Регенерационный остеогенез на границе ткань костнопластический материал

Полный текст

ОБОСНОВАНИЕ

Под клеточной физиологической и репаративной регенерацией тканей (регенерационным гистогенезом) принято подразумевать закономерный процесс повреждения и гибели ткани, миграции и пролиферации её камбиальных элементов, их дифференцировки, синтеза, интеграции и активного функционирования. Костная ткань в связи со специфической организацией межклеточного вещества обладает рядом особенностей этого процесса. В частности, этапам миграции и дифференцировки клеток-предшественниц должна предшествовать резорбция высокоминерализованного и структурированного матрикса, осуществляемого специализированными многоядерными клетками гематогенного генеза - остеокластами. Таким образом, пространственно-временная интеграция основных клеточных дифферонов костной ткани – остеокластического, остеоболастического и вспомогательных – гистоцитарного, фиброцитарного, эндотелиального и др. является важнейшим условием обеспечения гисто- и органтотипического восстановления [1-3]. Естественным образом вышеописанный процесс реализуется, в частности, у пациентов после костной пластики при дентальной имплантации. Одними из наиболее распространенных методик по увеличению объема костной ткани являются синус-лифтинг, или внутреннее увеличение объема костной ткани в области дна гайморовой пазухи, и направленная костная регенерация, или увеличение наружного объема альвеолярного отростка с применением барьерных мембран для костной регенерации. И в том, и в другом случаях для достижения будущей стабильности имплантата используются костнозамещающие скаффолды. Одним из наиболее перспективных изделий для костной пластики следует считать активированные остеопластические материалы, характеризующиеся наличием факторов роста (белками), живых клеток или генных конструкций, кодирующих факторы роста [4]. Механизм действия и влияние на процесс репаративной регенерации при их применении отличаются и имеют свои особенности, требующие углубленного изучения.

Цель исследования – оценка тканевого состава костного регенерата, сформированного под влиянием ген-активированного материала (ГАМ) с теоретических позиций выявления БМЕ на различных этапах функционирования.

 

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В исследование было включено 30 биоптатов костной ткани полученных через 6 месяцев после проведения классической (двухэтапной) дентальной имплантации в области верхней и нижней челюстей с использованием материала на основе ксеногенного костного матрикса (ККМ) «Bio-Oss» (Geistlich, Швейцария, n=15) и синтетического ГАМ «Гистографт» («Гистографт», Россия, n=15), состоящего из гранул октакальциевого фосфата и плазмидной ДНК, несущей ген фактора роста эндотелия сосудов (vegf). Биоптаты забирали трепанами с внутренним диаметром 3 мм, которые использовали вместо пилотных свёрел при подготовке ложа для установки дентальных имплантатов. Результаты оценивали посредством микрофокусной компьютерной томографии, гистологического и иммуногистохимического исследований, а также гистоморфометрии.

            Микрофокусная компьютерная томография. После завершения операции сформированные биоптаты костной ткани фиксировали в 10% забуференном растворе формалина и проводили рентгенологическое исследование на образце отечественного микрофокусного томографа, разработанного на кафедре ЭПУ СПбГЭТУ «ЛЭТИ». Образец костного регенерата размещали на специализированном предметном столике, расположенном между источником и детектором рентгеновского излучения. Набор проекционных данных был получен при неподвижных детекторе и источнике излучения, и вращении объекта контроля вокруг своей оси. Контроль производился при ускоряющем анодном напряжении 100 кВ, токе 20 мкА, времени экспозиции 1000 мс. Реконструкция полученного набора проекционных данных осуществлялась на основе алгоритма обратного проецирования с фильтрацией и свёрткой. Размер вокселя реконструированного объема объекта контроля составил менее 10 мкм. Анализ полученных результатов проводили с помощью программного обеспечения для объёмной визуализации CTvox (Bruker, США).

            Гистологическое и иммуногистохимическое исследования. Изготовление гистологических препаратов осуществлялось на кафедре патологической анатомии Северо-Западного государственного медицинского университета имени И. И. Мечникова  по стандартной методике для костной ткани, включая этап декальцинации, которую проводили в растворе «Софтидек» (Биовитрум, Россия) при соотношении объема объекта и объема декальцинирующей жидкости 1:50 в течение 12 часов [5]. После завершения декальцинации образцы промывали водопроводной водой в течение 30 мин. Гистологическую проводку, заливку, и микротомию при толщине срезов 3-5 мкм осуществляли по стандартной методике. Препараты окрашивали обзорными красителями (гематоксилином и эозином), по Маллори, по Массону-Голднеру, осуществляли импрегнацию нитратом серебра по Гордону, проводили иммуногистохимическое исследование с антителами к карбоангидразе II (CA2) для подсчета резорбирующих материал клеток и CD31 (OriGene, США) для визуализации вновь образованных кровеносных сосудов.

            Гистоморфометрическое исследование. Для изучения способности графтов к резорбции были подсчитаны остаточная площадь фрагментов исследуемых материалов и число резорбирующих материал клеток на поверхности каждого из них в пределах биоптата. Также был введет параметр индекса резорбции (рис. 1), представляющий собой число остеокластов на мм² площади остатков имплантируемого материала. Для нивелирования влияния выбросов параметров площади на предполагаемо-зависимый параметр плотности остеокластов, измерения, пересекающие полуторный межквартильный интервал ниже и выше медианных значений, были удалены из данных статистических анализов: 237 измерений (суммарно по двум группам) были приведены к размеру выборки в 226 измерений.

            Статистическая обработка данных. Для обработки полученных данных использовали IBM SPSS Statistics 26.0. Описательные статистики представляли в виде медианы (квартиль 1, квартиль 3) - Me (Q1; Q3). В каждой группе оценивали характер распределения. Для сравнения двух выборок, несоответствующих нормальному распределению - использовали критерий Манна-Уитни, а для множественных сравнений - критерий Краскела-Уоллиса.

Результаты

По результатам микрофокусной компьютерной томографии микрогранулы ККМ были распространены по всему объёму исследуемого биоптата. Рентгеновская плотность материала была крайне близка к плотности вновь образованной костной ткани, в связи с чем часть фрагментов этого ординарного изделия не различалась с костным регенератом. Межбалочное пространство и пространство вокруг микрогранул, не окружённых костью, было занято волокнистой соединительной тканью.

При исследовании биоптатов с имплантированным ГАМ фрагменты ОКФ аналогичным образом были распределены по всей площади биоптата. Микрогранулы изделия обладали более высокой, по сравнению с костной тканью, рентгенологической плотностью, были окружены сетью одноразмерных костных балок, формирующих каркас регенерата. Признаков формирования соединительнотканной капсулы, окружающей исследуемые материалы, не было обнаружено (рис. 2).

По результатам гистологического исследования структура костного регенерата, сформированного при имплантации ККМ, была представлена сетью костных трабекул преимущественно пластинчатой костной ткани, окружающих нерезорбированные фрагменты остеопластического материала (рис. 3А). Вместе с тем, ряд межбалочных пространств был заполнен рыхлой волокнистой соединительной тканью, диффузно инфильтрированной единичными гистиоцитами и лимфоцитами. Часть соединительной ткани граничила с фрагментами ксенографта. В единичных полях зрения были выявлены участки активного неоостеогенеза – на поверхности фрагментов материала был визуализирован остеоид (рис. 3C). Тем не менее, проникновение коллагена непосредственно в структуру гранул не происходило – волокна выстилали поверхность фрагментов ксеногенного материала (рис. 3E). Единичные резорбирующие материал клетки, характерные для стадии резорбции, определялись на поверхности гранул и характеризовались отсутствием гофрированной каёмки (рис. 3G). Остеобласты, необходимые для синтеза костного матрикса не были обнаружены ни в одном биоптате.

Костные биоптаты с имплантированным ГАМ были представлены мультитканевым регенератом, состоящим из костной ткани смешанного типа, волокнистой соединительной ткани, а также фрагментов ОКФ. Микрогранулы изделия, в большинстве случаев, были диффузно распространены по всей площади гистологического микропрепарата и окружены сетью трабекул костной ткани смешанного строения (рис. 3B). Большая часть гранул через 6 месяцев была полностью замкнута в балочной системе – поверхность ОКФ плотно соприкасалась с вновь образованной пластинчатой костной тканью. Однако, встречались гранулы, на поверхности которых были сформированы остеоид и тонкие трабекулы ретикулофиброзной костной ткани (рис. 3D).

При импрегнации нитратом серебра отчётливо визуализировались аргирофильные волокна, выстилающие поверхность ОКФ и проникающие непосредственно в его структуру (рис. 3F).

На поверхность гранул, частично замкнутых в трабекулярную сеть, было расположено множество резорбирующих клеток. В ряде случаев, гранулы были полностью ими окружены (рис. 3H). Вместе с тем, на поверхности вновь образованных костных балок определялись активные остеобласты, синтезирующие косный матрикс (рис. 4).

Признаки воспалительной реакции, формирования соединительнотканной капсулы не были выявлены ни в одном из исследуемых биоптатов.

При иммуногистохимическом исследовании на эндотелиоциты (CD31⁺) была выявлена богаторазвитая кровеносная сеть, включающая все звенья микроциркуляторного русла от артериол до венул и более крупных сосудов во всем исследуемом костном регенерате. Как при использовании ГАМ, так и при использовании материала на основе ККМ кровеносные сосуды располагались в волокнистой соединительной ткани, окружающей костнозамещающие материалы и заполняющей межбалочные пространства. Проникновение кровеносных сосудов непосредственно в толщу фрагментов остеопластических графтов не было выявлено (рис. 4 A, B).

По результатам ИГХ исследования с антителами к карбоангидразе II, вовлеченной во внеклеточную ацидификацию и необходимую для костной резорбции поверхности кости остеокластами [6], клетки CA2⁺, резорбирующие микрогранулы ККМ практически отсутствовали. Вместе с тем, поверхность фрагментов ГАМ была обильно выстлана активными гигантскими многоядерными клетками-остеокластами (рис. 4 C, D).

По результатам гистоморфометрического исследования в группе с использованием ГАМ медианная площадь нерезорбированных гранул составила 0,039 мм² (Q1=0,013 мм²; Q3=0,079 мм²), а плотность остеокластов 67 клеток/мм² (Q1=22 клетки/мм²; Q3=235 клеток/мм2). В группе с использованием ККМ медианная площадь составила 0,029 мм² (Q1=0,009 мм²; Q3=0,068 мм²), а плотность остеокластов 15 клеток/мм² (Q1=0 клеток/мм²; Q3=79 клеток/мм2). При сравнивании распределений критерием Манна-Уитни было установлено отсутствие статистических значимых отличий в показателях площади остаточного имплантируемого материала в биоптатах (p = 0,129) и наличие статистических значимых различий по плотности остеокластов (p < 0,0001) (рис. 6, 7).

Обсуждение

Первые попытки внедрения костной пластики как способа замещения дефектов скелета человека датируются приблизительно 2000 г до н.э. [7]. История остеопластики неразрывна с постоянным поиском наиболее оптимального материала для замещения костных дефектов. Так, первые прототипы костных графтов были представлены фрагментами костей различных животных [8-10], более поздние - аллогенными костными фрагментами ампутированных конечностей и аутогенной костной тканью. Последняя и по сей день остаётся «золотым» стандартом остеозамещающих материалов из-за своих остеокондуктивных и остеоиндуктивных свойств. В этой связи разработка новых костнопластических графтов сводится к поиску материалов, способных «обмануть» организм человека с целью сделать процесс остеорегенерации наиболее нативным, что обеспечит наилучший исход лечения.

Ремоделирование костной ткани – постоянно находящийся в балансе механизм костеобразования, состоящий из последовательных процессов резорбции и остеогенеза посредством БМЕ [11]. Репаративная регенерация начинается с активации клеток покоящейся зоны при помощи специфических цитокинов (начальная фаза), в ходе которой на костном матриксе происходит разрушение протективного слоя и к оголенной поверхности мигрируют предшественники остеокластов. Затем начинается резорбтивная фаза, обуславливающая разрушение кости от периферии к центральной части. На следующем этапе – фазе реверсии, мононуклеарные клетки макрофаги подготавливают поверхность кости, осуществляя удаление остатков неутилизированного органического матрикса, для последующего синтеза остеобластами нового костного вещества. На этом фоне продуцируются сигналы перехода от стадии резорбции к стадии формирования кости, осуществляющейся остеобластами. Завершением этой цепочки является сформировавшийся за счёт нового костного матрикса остеон, находящийся в состоянии покоя [12, 13].

При использовании ГАМ в качестве костного заменителя было обнаружено, что репаративная регенерация имеет ряд особенностей, присущих нативной регенерации костной ткани. Каждый исследуемый костный регенерат содержал БМЕ на разных стадиях ремоделирования. На начальной стадии клетки-предшественники остеокластов перемещались на поверхность гранул ГАМ, обуславливая последующую резорбцию остеопластического материала. Осуществляющие разрушение материала клетки были визуализированы при окраске по Массону-Голднеру, а также в ходе иммуногистохимической реакции с антителами к карбоангидразе 2, необходимой остеокластам для ацидофикации как костного матрикса, так и матрикса синтетического. На стадии реверсии BME характеризовались одновременным содержанием резорбирующих клеток, макрофагов, и предшественников остеобластов в одной локализации. Остеокластоподобные клетки в этот период обладали сниженной активностью – их размеры и количество были меньшими в сравнении с фазой резорбции. Фаза образования характеризовалась активным синтезом костного матрикса на поверхности гранул ГАМ за счёт активных остеобластов и молодых остеоцитов. Финалом процесса ремоделирования следует считать фрагмент ГАМ без признаков продолжающейся резорбции, полностью окруженный вновь образованной костью со всех сторон.

Заключение

Таким образом следует заключить, что процесс репаративной регенерации при использовании ген-активированного остеопластического материала на основе ОКФ осуществляется за счёт последовательной работы БМЕ, что делает его максимально близким к оригинальному процессу естественного восстановления костной ткани.

 

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ Информация

Источник финансирования. Исследование не имело спонсорской поддержки и было выполнено за счёт исследователей.

Конфликт интересов. Е.В. Пресняков, И.Я. Бозо, Р.В. Деев являются действующими сотрудниками ООО «Гистографт».

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).  Наибольший вклад распределён следующим образом: Е.В. Пресняков  — сбор и обработка материала, написание текста; Х.Р. Курбонов — обзор литературы, сбор и обработка материала, написание текста; И.П. Сорочану — обзор литературы, сбор и обработка материала, написание текста; Н.И. Жемков — сбор и обработка материала, написание текста; Д.Ф. Галбацов – сбор и обработка материала, написание текста; П.С. Подлужный – сбор и обработка материала; И.А. Ларионов – проведение микрофокусной компьютерной томографии, обработка полученных результатов; В.Б. Бессонов – проведение микрофокусной компьютерной томографии, обработка полученных результатов; А.М. Емелин – сбор и обработка материала, написание текста; И.Я. Бозо – концепция и дизайн исследования, написание и редактирование текста; Р.В. Деев — концепция и дизайн исследования, написание и редактирование текста.

 

Рис. 1. Формула для вычисления индекса резорбции.

Рис. 2.   Распределение гранул остеопластического материала в биоптате: 1 – фрагменты материала «Гистографт»; 2 – костный регенерат. Масштабный отрезок 1 мм. Компьютерная томограмма

Рис. 3.   Особенности костного регенерата при использовании ККМ (левый столбец) и ГАМ (правый столбец): 1 – фрагменты остеопластического материала; 2 – вновь образованная костная ткань; 3 – соединительная ткань с разной степенью упорядоченности коллагеновых волокон; 4 – остеоид; 5 – коллагеновые волокна (коричневые); 6 – аргирофильные волокна (черные); 7 – многоядерные клетки, резорбирующие материал; 8 – макрофаги. Окраска: A, G – гематоксилин и эозин; B – трихром по Маллори; C, D, H – трихром по Массону-Голднеру, E, F – импрегнация нитратом серебра.  Масштабный отрезок указан на изображениях

Рис. 4.   Поверхность остеобластической активности при использовании остеопластического материала на основе ОКФ. 1 – вновь образованная костная ткань; 2 – микрогранулы ОКФ; 3 – плотная волокнистая соединительная ткань; 4 – активные остеобласты, синтезирующие костный матрикс; 5 – макрофаги. Масштабный отрезок: А – 20 мкм; Б – 50 мкм. Окраска: трихром по Массону-Голднеру. Масштабный отрезок указан на изображениях

Рис. 5.   Пример ИГХ-реакции с антителами к CD31 (верхний ряд) и к CA2 (нижний ряд). Эндотелиоциты – клетки с цитоплазматическим паттерном окрашивания. Остеокласты – крупные многоядерные клетки с цитоплазматическим паттерном окрашивания. Продукт реакции коричневого цвета. А, C – материал на основе ККМ; B, D – материал на основе ОКФ. Докраска гематоксилином Майера. Масштабный отрезок указан на изображениях

Рис. 6.   Площадь нерезорбированных фрагментов остеопластических материалов через 6 месяцев после имплантации. «Bio-Oss» – ординарные изделия на основе ксеногенного костного матрикса; «Гистографт» – ген-активированные синтетические изделия на основе октакальциевого фосфата

Рис. 7.   Индекс остеокластов через 6 месяцев после имплантации. «Bio-Oss» – ординарные изделия на основе ксеногенного костного матрикса; «Гистографт» – ген-активированные синтетические изделия на основе октакальциевого фосфата

 

Об авторах

Евгений Валерьевич Пресняков

НКЦ №2 ФГБНУ "Российский научный центр хирургии имени академика Б.В. Петровского"; ФГБНУ Научно-исследовательский институт морфологии человека имени академика А.П. Авцына; ООО «Гистографт»

Автор, ответственный за переписку.
Email: uvpres@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-1546-5129
https://www.researchgate.net/profile/Evgeny-Presnyakov

врач-патологоанатом, научный сотрудник R&D отдела, научный сотрудник лаборатории патологии и морфологии опорно-двигательного аппарата

Россия

Хуршед Рахматуллоевич Курбонов

Email: hakagureo@gmail.com

Ирина Сорочану

Email: ipsorochanu@gmail.com

Никита Игоревич Жемков

Email: zhemkovni@gmail.com

Джамал Фадиевич Галбацов

Email: dzhamal.galbatcov61@gmail.com

Павел Сергеевич Подлужный

Email: paul_podluzhny@mail.ru

Иван Алексеевич Ларионов

Email: ivan.al.larionov@gmail.com

Виктор Борисович Бессонов

Email: vbbessonov@yandex.ru

Алексей Михайлович Емелин

Email: eama40rn@gmail.com

Илья Ядигерович Бозо

Email: bozo.ilya@gmail.com

Роман Вадимович Деев

Email: romdey@gmail.com

Список литературы

Дополнительные файлы