Regenerative osteogenesis at the interface of tissue–osteoplastic material

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Ремоделирование костной ткани — постоянно находящийся в балансе механизм костеобразования, состоящий из последовательных процессов резорбции и остеогенеза посредством базисных многоклеточных единиц (БМЕ) [1]. Репаративная регенерация начинается с активации клеток покоящейся зоны при помощи специфических цитокинов (начальная фаза), в ходе которой на костном матриксе происходит разрушение протективного слоя и к оголённой поверхности мигрируют предшественники остеокластов. Затем начинается резорбтивная фаза, обусловливающая разрушение кости от периферии к центральной части. На следующем этапе — фазе реверсии — мононуклеарные клетки-макрофаги подготавливают поверхность кости, осуществляя удаление остатков неутилизированного органического матрикса, для последующего синтеза остеобластами нового костного вещества. На этом фоне продуцируются сигналы перехода от стадии резорбции к стадии формирования кости, осуществляющегося остеобластами. Завершением этой цепочки является сформировавшийся за счёт нового костного матрикса остеон, находящийся в состоянии покоя [2, 3].

Таким образом, пространственно-временная интеграция основных (остеокластического, остеобластического) и вспомогательных (гистоцитарного, фиброцитарного, эндотелиального и др.) клеточных дифферонов костной ткани является важнейшим условием обеспечения гисто- и органотипического восстановления [4–6]. Естественным образом вышеописанный процесс реализуется, в частности, у пациентов после костной пластики при дентальной имплантации. Одними из наиболее распространённых методик по увеличению объёма костной ткани являются синус-лифтинг (внутреннее увеличение объёма костной ткани в области дна гайморовой пазухи) и направленная костная регенерация (увеличение наружного объёма альвеолярного отростка с применением барьерных мембран для костной регенерации). И в том, и в другом случае для достижения будущей стабильности имплантата используются костнозамещающие скаффолды. Одним из наиболее перспективных изделий для костной пластики следует считать активированные остеопластические материалы, характеризующиеся наличием факторов роста (белков), живых клеток или генных конструкций, кодирующих факторы роста [7]. Механизм действия и влияние на процесс репаративной регенерации при их применении отличаются и имеют свои особенности, требующие углублённого изучения.

Цель исследования — изучение тканевого состава костного регенерата, сформированного под влиянием ген-активированного материала, с теоретических позиций выявления базисных многоклеточных единиц на различных этапах функционирования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Проведено экспериментальное проспективное выборочное неконтролируемое исследование 30 биоптатов костной ткани, полученных через 6 мес после классической (двухэтапной) дентальной имплантации в области верхней и нижней челюстей с использованием материала на основе ксеногенного костного матрикса (ККМ) Bio-Oss (Geistlich, Швейцария) (n=150) и синтетического ген-активированного материала (ГАМ) «Гистографт» («Гистографт», Россия) (n=15), состоящего из гранул октакальциевого фосфата (ОКФ) и плазмидной ДНК, несущей ген фактора роста эндотелия сосудов vegf. Биоптаты забирали трепанами с внутренним диаметром 3 мм, которые использовали вместо пилотных свёрл при подготовке ложа для установки дентальных имплантатов. Результаты оценивали посредством микрофокусной компьютерной томографии, гистологического и иммуногистохимического исследований, а также гистоморфометрии.

Микрофокусная компьютерная томография. После завершения операции сформированные биоптаты костной ткани фиксировали в 10% забуференном растворе формалина и проводили рентгенологическое исследование на образце отечественного микрофокусного томографа, разработанного на кафедре электронных приборов и устройств СПбГЭТУ «ЛЭТИ». Образец костного регенерата размещали на специализированном предметном столике, расположенном между источником и детектором рентгеновского излучения. Набор проекционных данных был получен при неподвижных детекторе и источнике излучения, а также при вращении объекта контроля вокруг своей оси. Контроль производили при ускоряющем анодном напряжении 100 кВ, токе 20 мкА, время экспозиции — 1000 мс. Реконструкцию полученного набора проекционных данных осуществляли на основе алгоритма обратного проецирования с фильтрацией и свёрткой. Размер вокселя реконструированного объёма объекта контроля составил менее 10 мкм. Анализ полученных результатов проводили с помощью программного обеспечения для объёмной визуализации CTvox (Bruker, США).

Гистологическое и иммуногистохимическое исследования. Изготовление гистологических препаратов осуществляли на кафедре патологической анатомии Северо-Западного государственного медицинского университета имени И. И. Мечникова по стандартной методике для костной ткани (включая этап декальцинации), которую проводили в растворе «Софтидек» («БиоВитрум», Россия) при соотношении объёма объекта и объёма декальцинирующей жидкости 1:50 в течение 12 ч [8]. После завершения декальцинации образцы промывали водопроводной водой в течение 30 мин. Гистологическую проводку, заливку и микротомию при толщине срезов 3–5 мкм осуществляли по стандартной методике. Препараты окрашивали обзорными красителями (гематоксилином и эозином), по Маллори, по Массону–Голднеру, осуществляли импрегнацию нитратом серебра по Гордону, проводили иммуногистохимическое исследование с антителами к карбоангидразе II (AP08499HR-N; OriGene, США, CA2) в разведении 1:2000 для подсчёта резорбирующих материал клеток и CD31 (NB600–562SS; Novus Biologicals, США) в разведении 1:100 для визуализации вновь образованных кровеносных сосудов.

Гистоморфометрическое исследование. Для изучения способности графтов к резорбции были подсчитаны остаточная площадь фрагментов исследуемых материалов и число резорбирующих материал клеток на поверхности каждого из них в пределах биоптата. Кроме того, введён параметр индекса резорбции, представляющего собой число остеокластов на мм² площади остатков имплантируемого материала:

$Индекс резорбции = \frac{Число резорбирующих клеток, шт.}{S фрагмента остеопластического материала, мкм2}$

Для нивелирования влияния выбросов параметров площади на предполагаемо-зависимый параметр плотности остеокластов измерения, пересекающие полуторный межквартильный интервал ниже и выше медианных значений, удалены из данных статистических анализов: 237 измерений (суммарно по двум группам) приведены к размеру выборки в 226 измерений.

Статистическая обработка данных

Размер выборки предварительно не рассчитывался.

Для обработки полученных данных использовали пакет программ SPSS Statistics 26.0 (IBM, США). Описательные статистики представляли в виде медианы, первого и третьего квартилей (Me [Q1; Q3]). В каждой группе оценивали характер распределения с использованием критерия Колмогорова–Смирнова. Для сравнения двух выборок, несоответствующих нормальному распределению, применяли критерий Манна–Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ

По результатам микрофокусной компьютерной томографии установлено, что микрогранулы ККМ распространены по всему объёму исследуемого биоптата. Рентгеновская плотность материала крайне близка к плотности вновь образованной костной ткани, в связи с чем часть фрагментов этого ординарного изделия не различалась с костным регенератом. Межбалочное пространство и пространство вокруг микрогранул, не окружённых костью, было занято волокнистой соединительной тканью.

При исследовании биоптатов с имплантированным ГАМ фрагменты ОКФ аналогичным образом были распределены по всей площади биоптата. Микрогранулы изделия обладали более высокой по сравнению с костной тканью рентгенологической плотностью, были окружены сетью одноразмерных костных балок, формирующих каркас регенерата. Признаков формирования соединительнотканной капсулы, окружающей исследуемые материалы, не обнаружено (рис. 1).

 

Рис. 1. Компьютерная томограмма, показывающая распределение гранул остеопластического материала в биоптате: 1 — фрагменты материала «Гистографт»; 2 — костный регенерат. Бар — 1 мм.

 

По результатам гистологического исследования структура костного регенерата, сформированного при имплантации ККМ, представлена сетью костных трабекул преимущественно пластинчатой костной ткани, окружающих нерезорбированные фрагменты остеопластического материала (рис. 2, a). Вместе с тем ряд межбалочных пространств был заполнен рыхлой волокнистой соединительной тканью, диффузно инфильтрированной единичными гистиоцитами и лимфоцитами. Часть соединительной ткани граничила с фрагментами ксенографта. В единичных полях зрения были выявлены участки активного неоостеогенеза: на поверхности фрагментов материала визуализирован остеоид (рис. 2, с). Тем не менее проникновения коллагена непосредственно в структуру гранул не происходило, волокна выстилали поверхность фрагментов ксеногенного материала (рис. 2, e). Единичные резорбирующие материал клетки, характерные для стадии резорбции, определялись на поверхности гранул и характеризовались отсутствием гофрированной каёмки (рис. 2, g). Остеобласты, необходимые для синтеза костного матрикса, не обнаружены ни в одном биоптате.

 

Рис. 2. Особенности костного регенерата при использовании ксеногенного костного матрикса (левый столбец) и ген-активированного материала (правый столбец): 1 — фрагменты остеопластического материала; 2 — вновь образованная костная ткань; 3 — соединительная ткань с разной степенью упорядоченности коллагеновых волокон; 4 — остеоид; 5 — коллагеновые волокна (коричневые); 6 — аргирофильные волокна (чёрные); 7 — многоядерные клетки, резорбирующие материал; 8 — макрофаги. Окраска: a, g — гематоксилин и эозин; b — трихром по Маллори; c, d, h — трихром по Массону–Голднеру; e, f — импрегнация нитратом серебра.

 

Костные биоптаты с имплантированным ГАМ представлены мультитканевым регенератом, состоящим из костной ткани смешанного типа, волокнистой соединительной ткани, а также фрагментов ОКФ. Микрогранулы изделия в большинстве случаев были диффузно распространены по всей площади гистологического микропрепарата и окружены сетью трабекул костной ткани смешанного строения (рис. 2, b). Большая часть гранул через 6 мес была полностью замкнута в балочной системе — поверхность ОКФ плотно соприкасалась с вновь образованной пластинчатой костной тканью. Однако встречались гранулы, на поверхности которых были сформированы остеоид и тонкие трабекулы ретикулофиброзной костной ткани (рис. 2, d).

При импрегнации нитратом серебра отчётливо визуализировались аргирофильные волокна, выстилающие поверхность ОКФ и проникающие непосредственно в его структуру (рис. 2, f).

На поверхности гранул, частично замкнутых в трабекулярную сеть, расположено множество резорбирующих клеток; в ряде случаев гранулы были полностью ими окружены (рис. 2, h). Вместе с тем на поверхности вновь образованных костных балок определялись активные остеобласты, синтезирующие костный матрикс (рис. 3).

 

Рис. 3. Поверхность остеобластической активности при использовании остеопластического материала на основе октакальциевого фосфата: 1 — вновь образованная костная ткань; 2 — микрогранулы октакальциевого фосфата; 3 — плотная волокнистая соединительная ткань; 4 — активные остеобласты, синтезирующие костный матрикс; 5 — макрофаги. Окраска: трихром по Массону–Голднеру.

 

Признаки воспалительной реакции, формирования соединительнотканной капсулы не выявлены ни в одном из исследуемых биоптатов.

При иммуногистохимическом исследовании на эндотелиоциты (CD31) выявлена богато развитая кровеносная сеть, включающая все звенья микроциркуляторного русла от артериол до венул и более крупных сосудов во всём исследуемом костном регенерате. Как при использовании ГАМ, так и при использовании материала на основе ККМ кровеносные сосуды располагались в волокнистой соединительной ткани, окружающей костнозамещающие материалы и заполняющей межбалочные пространства. Проникновения кровеносных сосудов непосредственно в толщу фрагментов остеопластических графтов не выявлено (рис. 4, a, b).

 

Рис. 4. Пример иммуногистохимической реакции с антителами к CD31 (верхний ряд) и к CA2 (нижний ряд): эндотелиоциты — клетки с цитоплазматическим паттерном окрашивания; остеокласты — крупные многоядерные клетки с цитоплазматическим паттерном окрашивания; продукт реакции — коричневого цвета; а, c — материал на основе ксеногенного костного матрикса (ККМ); b, d — материал на основе октакальциевого фосфата (ОКФ). Докраска гематоксилином Майера.

 

По результатам иммуногистохимического исследования с антителами к карбоангидразе II, вовлечённой во внеклеточную ацидификацию и необходимой для костной резорбции поверхности кости остеокластами [6], клетки CA2⁺, резорбирующие микрогранулы ККМ, практически отсутствовали. Вместе с тем поверхность фрагментов ГАМ была обильно выстлана активными гигантскими многоядерными клетками-остеокластами (рис. 4, c, d).

По результатам гистоморфометрического исследования в группе с использованием ГАМ медианная площадь нерезорбированных гранул составила 0,039 [0, 013; 0, 079] мм², а плотность остеокластов — 67 [22; 235] кл./мм². В группе с использованием ККМ медианная площадь составила 0,029 [0, 009; 0, 068] мм² и 15 [0; 79] кл./мм².При использовании критерия Колмогорова–Смирнова выявлено, что данные в выборках не соответствуют закону нормального распределения (p <0,05). В ходе сравнивания данных с помощью критерия Манна–Уитни установлены отсутствие статистических значимых различий в показателях площади остаточного имплантируемого материала в биоптатах (p=0,129) и наличие статистических значимых различий по плотности остеокластов (p <0,0001) (рис. 5, 6).

 

Рис. 5. Площадь нерезорбированных фрагментов остеопластических материалов через 6 мес после имплантации: Bio-Oss — ординарные изделия на основе ксеногенного костного матрикса; «Гистографт» — ген-активированные синтетические изделия на основе октакальциевого фосфата.

 

Рис. 6. Индекс остеокластов через 6 мес после имплантации: Bio-Oss — ординарные изделия на основе ксеногенного костного матрикса; «Гистографт» — ген-активированные синтетические изделия на основе октакальциевого фосфата.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

При использовании ГАМ в качестве костного заменителя обнаружено, что репаративная регенерация имеет ряд особенностей, присущих нативной регенерации костной ткани. Каждый исследуемый костный регенерат содержал БМЕ на разных стадиях ремоделирования. На начальной стадии клетки-предшественники остеокластов перемещались на поверхность гранул ГАМ, обусловливая последующую резорбцию остеопластического материала. Осуществляющие разрушение материала клетки были визуализированы при окраске по Массону–Голднеру, а также в ходе иммуногистохимической реакции с антителами к карбоангидразе II, необходимой остеокластам для ацидофикации как костного матрикса, так и матрикса синтетического. На стадии реверсии БME характеризовались одновременным содержанием резорбирующих клеток, макрофагов и предшественников остеобластов в одной локализации. Остеокластоподобные клетки в этот период обладали сниженной активностью: их размеры и количество были меньшими в сравнении с фазой резорбции. Фаза образования характеризовалась активным синтезом костного матрикса на поверхности гранул ГАМ за счёт активных остеобластов и молодых остеоцитов. Финалом процесса ремоделирования следует считать фрагмент ГАМ без признаков продолжающейся резорбции, полностью окружённый вновь образованной костью со всех сторон.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведённого исследования установлено, что процесс репаративной регенерации при использовании ген-активированного остеопластического материала на основе октакальциевого фосфата осуществляется за счёт последовательной работы базисных многоклеточных единиц, что делает его максимально близким к оригинальному процессу естественного восстановления костной ткани.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Конфликт интересов. Е. В. Пресняков, И. Я. Бозо, Р. В. Деев являются действующими сотрудниками ООО «Гистографт». Другие члены авторского коллектива декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией). Наибольший вклад распределён следующим образом: Е. В. Пресняков, Н. И. Жемков, Д. Ф. Галбацов, А. М. Емелин — сбор и обработка материала, написание текста; Х. Р. Курбонов, И. П. Сорочану — обзор литературы, сбор и обработка материала, написание текста; П. С. Подлужный —сбор и обработка материала; И. А. Ларионов, В. Б. Бессонов —проведение микрофокусной компьютерной томографии, обработка полученных результатов; И. Я. Бозо, Р. В. Деев — концепция и дизайн исследования, написание и редактирование текста.

ADDITIONAL INFORMATION

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

Competing interests. E. V. Presnyakov, I.Ya. Bozo, R. V. Deev are current employees of Histograft LLC. Other authors declare that they have no competing interests.

Authors’ contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work. E. V. Presnyakov, N. I. Zhemkov, D. F. Galbatsov, A. M. Emelin — collection and processing of material, writing the text; Kh.R. Kurbonov, I. P. Sorochanu — literature review, collection and processing of material, writing the text; P. S. Podluzhny — collection and processing of material; I. A. Larionov, V. B. Bessonov — conducting microfocus computed tomography, processing the results; I.Ya. Bozo, R. V. Deev — conception and design of the study, writing and editing the text.

About the authors

Evgeniy V. Presnyakov

Petrovsky National Research Centre of Surgery; Histograft LLC

Author for correspondence.
Email: uvpres@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-1546-5129
SPIN-code: 4001-4715
Russian Federation, Moscow; Moscow

Khurshed R. Kurbonov

Samarkand State Medical University

Email: hakagureo@gmail.com
ORCID iD: 0009-0005-0554-4925
SPIN-code: 7441-9038
Uzbekistan, Samarkand

Irina P. Sorochanu

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

Email: ipsorochanu@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-6909-8937
SPIN-code: 4072-3845
Russian Federation, Saint Petersburg

Nikita I. Zhemkov

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

Email: zhemkovni@gmail.com
ORCID iD: 0009-0003-2423-6544
SPIN-code: 3779-4360
Russian Federation, Saint Petersburg

Dzhamal F. Galbatsov

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

Email: dzhamal.galbatcov61@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-7328-7503
SPIN-code: 8317-9216
Russian Federation, Saint Petersburg

Pavel S. Podluzhny

The N.N. Petrov National Medicine Research Center

Email: paul_podluzhny@mail.ru
ORCID iD: 0009-0003-0996-2759
SPIN-code: 7101-0526
Russian Federation, Saint Petersburg

Ivan A. Larionov

Saint Petersburg Electrotechnical University "LETI"

Email: ivan.al.larionov@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-9620-9471
SPIN-code: 8210-9840

Cand. Sci. (Technology)

Russian Federation, Saint Petersburg

Viktor B. Bessonov

Saint Petersburg Electrotechnical University "LETI"

Email: vbbessonov@etu.ru
ORCID iD: 0000-0001-9009-1011
SPIN-code: 9644-2444

Dr. Sci. (Technology), Assistant Professor

Russian Federation, Saint Petersburg

Aleksey M. Emelin

Petrovsky National Research Centre of Surgery

Email: eama40rn@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-4109-0105
SPIN-code: 5605-1140
Russian Federation, Moscow

Il’ya Ya. Bozo

Petrovsky National Research Centre of Surgery; Histograft LLC

Email: bozo.ilya@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-0138-5614
SPIN-code: 9083-5715

MD, Cand. Sci. (Medicine)

Russian Federation, Moscow; Moscow

Roman V. Deev

Petrovsky National Research Centre of Surgery

Email: romdey@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-8389-3841
SPIN-code: 2957-1687

MD, Cand. Sci. (Medicine), Assistant Professor

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files