Электронно-микроскопическое исследование кардиомиоцитов левого желудочка половозрелых крыс, рождённых недоношенными

Полный текст

Обоснование

Недоношенность является одним из факторов риска раннего развития заболеваний сердечно-сосудистой системы [1]. В последние годы проведены клинические исследования, целью которых явилось установление структурных основ функциональных изменений сердца подростков и взрослых, рождённых недоношенными. Обнаружено, что у недоношенных детей (преждевременные роды с 22-й по 37-ю акушерскую неделю) в подростковом и взрослом возрасте сердце более сферической формы [2], чем у доношенных сверстников, а в миокарде выражен интерстициальный фиброз [3, 4]. Однако по результатам клинических исследований невозможно составить представление о гистологических и ультраструктурных особенностях миокарда преждевременно рождённых людей в подростковом и взрослом возрасте. Всё вышеизложенное наряду с клиническими исследованиями свидетельствует о необходимости проведения экспериментальных работ, посвящённых данной проблеме.

Цель исследования ― выявление ультраструктурных особенностей кардиомиоцитов левого желудочка у недоношенных половозрелых крыс.

Материалы и методы

Дизайн исследования

Исследование является экспериментальным, одноцентровым, проспективным, выборочным, рандомизированным, контролируемым, неослеплённым.

Критерии соответствия

Исследование проведено на доношенных и недоношенных на 24 ч самцах крыс стока Вистар. Животных относили к одной из групп (доношенные и недоношенные) на основании продолжительности внутриутробного периода развития, при этом полная продолжительность беременности крыс Вистар в настоящем исследовании составила 22 сут.

Условия проведения

Исследование проведено на базе ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России. Животные содержались в стандартных условиях вивария.

Продолжительность исследования

Исследование проведено на 180-е сутки постнатального онтогенеза крыс Вистар для установления отдалённых эффектов недоношенности на структурные элементы кардиомиоцитов.

Описание медицинского вмешательства

Потомство получено от интактных самцов (2 мес, 200 г) и самок (3 мес, 200 г) крыс Вистар. Животных ссаживали на ночь, утром следующего дня для верификации коитуса анализировали влагалищный мазок. День обнаружения во влагалищном мазке сперматозоидов определяли как первый день беременности. Беременные самки случайным образом были разделены на тех, которые рожали естественным образом, и тех, кому стимулировали преждевременные роды. Доношенные животные получены в результате естественных, нестимулированных родов крыс. Преждевременные роды стимулировали однократной подкожной инъекцией антипрогестина мифепристона (1 мл, 10 мг/кг массы тела, Sigma-Aldrich, США) на 20-е сутки беременности. Введение антипрогестинов беременным крысам приводит к началу родов через 18–24 ч [5].

Основной исход исследования

Установление особенностей структурных элементов кардиомиоцитов недоношенных крыс на 180-е сутки постнатального онтогенеза.

Анализ в группах

Исследование проведено на доношенных (n=4, продолжительность беременности 22 сут) и недоношенных (n=4, продолжительность беременности 21 сут) половозрелых самцах крыс Вистар. Для верификации преждевременного рождения крыс взвешивали на момент рождения на лабораторных весах HL-100 (AND, Япония).

Методы регистрации исходов

Крыс выводили из эксперимента на 180-е сутки постнатального онтогенеза асфиксией углекислым газом, фрагменты миокарда средней трети латеральной стенки левого желудочка фиксировали в 4% параформальдегиде (Serva, Германия) в течение суток, далее в течение 3 ч ― в 1% тетраоксиде осмия (SPI, США); заливали в смесь смол Epon 812, Aralditе 502 и DDSA (SPI, США). Срезы толщиной 80 нм получали на ультратоме Leica ЕМ UC 7 (Leica, Австрия) и контрастировали уранил ацетатом и цитратом свинца. Ультраструктурное исследование проводили на трансмиссионном электронном микроскопе JEM-1400 (JEOL, Япония). Морфометрический анализ полученных изображений осуществляли в ImageJ 1.48 (NIH, США). На электронограммах продольных срезов сократительных кардиомиоцитов определяли относительные площади ядра, цитоплазмы, миофибрилл, митохондрий. Морфометрическому анализу подвергались не менее 5 кардиомиоцитов в каждом образце всех включённых в исследование животных.

Этическая экспертиза

Исследование выполнено при соблюдении Федерального закона РФ «О защите животных от жестокого обращения» от 01.01.1997. Протокол исследования одобрен локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России (№ 8475/1 от 30.11.2020).

Статистический анализ

Количественные показатели анализировали в программе SPSS 16.0 (IBM, США). Данные описательной статистики представлены в виде медианы и квартилей (Ме [Q1; Q3]). Проверку на нормальность распределения проводили при помощи критерия Шапиро–Уилка. Распределение не соответствует нормальному закону, поэтому для выявления различий между группами использован критерий Манна–Уитни. Уровень статистической значимости различий (p) принят за <0,05.

Результаты

Объекты (участники) исследования

На момент рождения масса недоношенных самцов крыс составила 4,3 г [4, 1; 4, 6], что статистически значимо (р=0,000) ниже массы доношенных самцов крыс 6,0 г [5, 7; 6, 2].

Основные результаты исследования

Ультраструктурное строение кардиомиоцитов недоношенных и доношенных крыс на 180-е сутки постнатального периода принципиально схоже (рис. 1).

Рис. 1. Миокард левого желудочка доношенных (а) и недоношенных (b) самцов крыс на 180-е сутки постнатального онтогенеза. Окрашивание уранил ацетатом и цитратом свинца, ×20 000 (а), ×12 000 (b). Звёздочкой (*) отмечено перинуклеарное набухание цитоплазмы кардиомиоцита у недоношенного животного.

Fig. 1. Myocardium of the left ventricle of term (a) and preterm (b) male rats, 180 days of postnatal ontogenesis. Uranyl acetate and lead citrate, ×20 000 (a), ×12 000 (b). Perinuclear swelling of the cytoplasm (*) of a cardiomyocyte of a preterm animal.

В миокарде обнаружены кардиомиоциты с двумя центрально расположенными ядрами овальной формы с преобладанием эухроматина. Однако относительная площадь ядер кардиомиоцитов у недоношенных крыс заметно ниже, а цитоплазмы ― выше, чем у доношенных животных (табл. 1). Наблюдаемые отличия связаны с развитием перинуклеарного набухания цитоплазмы в кардиомиоцитах недоношенных крыс (рис. 1, b).

Таблица 1. Относительная площадь структурных элементов кардиомиоцитов крыс

Table 1. Relative area of rat cardiomyocytes structural elements

* статистически значимые отличия от показателя доношенных крыс.

* statistically significant differences from the index of term rats.

Пучки миофибрилл в кардиомиоцитах недоношенных крыс ориентированы правильно, относительная площадь миофибрилл не отличается от таковой у доношенных крыс (см. табл. 1). В некоторых кардиомиоцитах недоношенных крыс миофибриллы истончены (рис. 2, а).

Рис. 2. Фрагмент цитоплазмы кардиомиоцита недоношенных самцов крыс (а, b) на 180-е сутки постнатального онтогенеза. Окрашивание уранил ацетатом и цитратом свинца, ×25 000 (а, b). Повреждение митохондрий обозначено стрелками; головки стрелок указывают на митохондрии с концентрическими кристами. Звёздочками (*) отмечено истончение миофибрилл.

Fig. 2. A fragment of the cytoplasm of a cardiomyocyte from preterm male rats (a, b) 180 days of postnatal ontogenesis. Uranyl acetate and lead citrate, ×25 000 (a, b). Mitochondrial damage (arrows). Mitochondria with concentric cristae (arrowshead ). Thinning of myofibrils (*).

Многочисленные митохондрии в кардиомиоцитах недоношенных крыс, как и у доношенных животных, имели субсарколеммальную, межмиофибриллярную и перинуклеарную локализацию. Различий в относительной площади митохондрий кардиомиоцитов у недоношенных и доношенных крыс на 180-е сутки постнатального онтогенеза не обнаружено (см. табл. 1). Однако в кардиомиоцитах недоношенных крыс определялись митохондрии с повреждениями внутренней или обеих мембран (см. рис. 2, а). Обнаруженные изменения выявлены в митохондриях независимо от их локализации в кардиомиоците. Исключительно у недоношенных крыс в кардиомиоцитах обнаружены митохондрии с концентрическими кристами (рис. 2, b). Обращает на себя внимание разрозненное расположение митохондрий в цитоплазме кардиомиоцитов недоношенных крыс, в то время как в клетках доношенных животных выявлены кластеры митохондрий (рис. 3).

Рис. 3. Фрагмент цитоплазмы кардиомиоцита доношенных (а) и недоношенных (b) самцов крыс на 180-е сутки постнатального онтогенеза. Окрашивание уранил ацетатом и цитратом свинца, ×18 000 (а), ×30 000 (b). Звёздочками (*) отмечена диссоциация кластеров митохондрий в цитоплазме кардиомиоцита недоношенного животного.

Fig. 3. A fragment of the cytoplasm of a cardiomyocyte from term (a) and preterm (b) male rats, 180 days of postnatal ontogenesis. Uranyl acetate and lead citrate, ×18 000 (a), ×30 000 (b). Dissociation of clasters of mitochondria in the cytoplasm of a cardiomyocyte of a preterm animal (*).

На 180-е сутки постнатального онтогенеза в кардиомиоцитах не наблюдали ультраструктурных изменений строения саркоплазматической сети и Т-трубочек, а также межклеточных контактов.

Обсуждение

Резюме основного результата исследования

Установлены ультраструктурные изменения в кардиомиоцитах недоношенных животных в отдалённом постнатальном периоде.

Обсуждение основного результата исследования

На сегодняшний день ультраструктурный анализ миокарда проведён только у недоношенных детей, умерших в неонатальном периоде [6, 7], тогда как отдалённые эффекты преждевременного рождения на структурные элементы кардиомиоцитов человека не описаны. Продемонстрированы не только меньшая степень дифференцировки кардиомиоцитов недоношенных новорождённых в сравнении с таковой у доношенных детей, но и признаки повреждения кардиомиоцитов, такие как перинуклеарный отёк, деструкция митохондриальных мембран [6, 7]. Влияет ли преждевременное рождение на ультраструктуру кардиомиоцитов в отдалённом постнатальном периоде онтогенеза, представляется интересным.

C этой целью проведены единичные экспериментальные исследования ультраструктуры кардиомиоцитов у животных, которым моделировали недоношенность. При моделировании недоношенности исследователями выбрана модель содержания доношенных грызунов в период новорождённости в гипероксических условиях [8]. Наше исследование проведено на крысах-самцах, рождённых на 24 ч ранее срока, поскольку, по нашему мнению, феномен недоношенности заключается в первую очередь в рождении организма со структурно и функционально незрелыми органами и не может быть приравнен исключительно к эффектам гипероксии.

Нами установлены структурно-функциональные изменения кардиомиоцитов недоношенных животных в отдалённом постнатальном периоде онтогенеза. Наблюдаемые в кардиомиоцитах недоношенных животных деструкция митохондриальных мембран, диссоциация кластеров митохондрий, а также концентрическая организация митохондриальных крист приводят к нарушению энергопродукции в клетках, а также разобщению процессов окисления и фосфорилирования, а кроме того, к продукции активных форм кислорода. В своём исследовании K.N. Goss и соавт. [8] продемонстрировали в отдалённом постнатальном периоде в миокарде крыс, которым моделировали недоношенность (неонатальная гипероксия), снижение активности супероксиддисмутазы 1 и 2. Повышенная продукция активных форм кислорода на фоне угнетения активности антиоксидантных ферментов может быть причиной выраженного окислительного стресса.

Причины появления митохондрий с концентрическим расположением крист не вполне изучены, однако известно, что подобная пространственная организация крист появляется при повреждении митохондриального или ядерного генома, в том числе в результате окислительного стресса [9, 10]. Пространственная организация крист обеспечивается белками и фосфолипидами внутренней мембраны митохондрий. Повреждение генома может приводить к нарушению функций как структурных белков, так и ферментов, ответственных за продукцию фосфолипидов митохондриальных мембран [11]. На модели недоношенности, заключающейся в содержании доношенных крыс в период новорождённости в условиях гипероксии, показано выраженное повреждение митохондриального генома в кардиомиоцитах в отдалённом постнатальном периоде онтогенеза (1 год) [8]. Повреждение фосфолипидов митохондриальных мембран, в частности кардиолипина, принимающего важное участие в пространственной организации крист, может быть вызвано и непосредственным действием активных форм кислорода [12, 13]. Кроме того, нарушение продукции кардиолипина может быть индуцировано гипоксией [14]. Нарушение количества или структуры кардиолипина может приводить к формированию концентрических крист в митохондриях [11]. Концентрическая организация крист митохондрий, по мнению А. Vincent и соавт. [10], приводит к снижению эффективности энергопродукции в них.

В кардиомиоцитах в норме митохондрии формируют структурно-функциональные кластеры. Координированное функционирование митохондрий в пределах кластера обусловлено наличием специфических белковых межмитохондриальных контактов [15]. В кардиомиоцитах недоношенных крыс митохондрии располагаются разрозненно, не формируя межмитохондриальных контактов. Таким образом, можно сделать вывод о функциональной дискоординации митохондрий кардиомиоцитов у недоношенных животных. Одной из причин диссоциации митохондрий из кластера является их повреждение. Известно также, что в состав кластера не входят делящиеся и новообразованные митохондрии [15].

Наблюдаемые в кардиомиоцитах недоношенных животных истончение миофибрилл и набухание перинуклеарной цитоплазмы могут быть следствием как энергодефицита, так и повреждения активными формами кислорода.

Таким образом, в отдалённом постнатальном периоде у преждевременно рождённых крыс, как и у недоношенных новорождённых детей [6, 7], в кардиомиоцитах наблюдаются набухание цитоплазмы и повреждение митохондрий. Следовательно, можно сделать вывод о длительных стереотипных нарушениях структурных элементов кардиомиоцитов, вызванных преждевременным рождением. Примечательно, что в отдалённом постнатальном периоде у людей, рождённых недоношенными, также продемонстрированы признаки нарушения энергетического метаболизма. В возрасте 25–26 лет в моноцитах людей, рождённых недоношенными, показано увеличение активности митохондриального окисления, но при этом ― снижение эффективности продукции аденозинтрифосфата [16].

Ограничения исследования

Ограничением исследования является малый объём выборки. В дальнейшем планируется сопоставление наблюдаемых структурных нарушений с результатами функциональных исследований активности и эффективности окислительного фосфорилирования в митохондриях кардиомиоцитов недоношенных крыс.

Заключение

Преждевременное рождение оказывает пролонгированное негативное влияние на ультраструктуру кардиомиоцитов. Наблюдаемые структурные изменения приводят к нарушению энергопродукции в кардиомиоцитах недоношенных крыс в отдалённом постнатальном периоде онтогенеза.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Исследование проведено при поддержке Российского научного фонда (проект № 24-25-00015).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией). Наибольший вклад распределён следующим образом: В.В. Иванова ― проведение эксперимента, сбор и анализ литературных источников, написание текста и редактирование статьи; И.В. Мильто ― проведение эксперимента, редактирование статьи.

Благодарности. Авторы выражают признательность ведущему инженеру ЦКП ИФПМ СО РАН «НАНОТЕХ», канд. физ.-мат. наук Миллеру Андрею Александровичу и заведующей Группой микроскопических исследований ИХБФМ СО РАН, д-ру биол. наук, профессору Рябчиковой Елене Ивановне за возможность проведения электронно-микроскопического исследования на современном оборудовании.

Additional information

Funding source. This work was supported by the Russian Science Foundation (project No. 24-25-00015).

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Authors’ contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work. V.V. Ivanovа ― experimental procedures, collection and analysis of literary sources, writing the text and editing the article; I.V. Milto ― experimental procedures, editing the article.

Acknowledgments. We thank the leading engineer of the Center for collective use of the Institute of Physics and Mathematics of the Russian Academy of Sciences “NANOTECH”, Candidate of Physical and Mathematical Sciences Andrey A. Miller and the head of the Microscopic Research Group of the Institute of Physical and Mathematical Physics of the SB RAS, Doctor of Biological Sciences, Professor Elena I. Ryabchikova for the opportunity to conduct electron microscopic research on a modern equipment.

Об авторах

Вера Владимировна Иванова

Автор, ответственный за переписку.
Email: ivvera92@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0002-2530-1112
SPIN-код: 9476-3329

канд. биол. наук

Иван Васильевич Мильто

Email: milto_bio@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9764-4392
SPIN-код: 4919-2033

д-р биол. наук, доцент

Список литературы

Дополнительные файлы

Доп. файлы

Действие

1. JATS XML

Скачать

2. Рис. 1. Миокард левого желудочка доношенных (а) и недоношенных (b) самцов крыс на 180-е сутки постнатального онтогенеза. Окрашивание уранил ацетатом и цитратом свинца, ×20 000 (а), ×12 000 (b). Звёздочкой (*) отмечено перинуклеарное набухание цитоплазмы кардиомиоцита у недоношенного животного.

Скачать (3MB)

Метаданные

3. Рис. 2. Фрагмент цитоплазмы кардиомиоцита недоношенных самцов крыс (а, b) на 180-е сутки постнатального онтогенеза. Окрашивание уранил ацетатом и цитратом свинца, ×25 000 (а, b). Повреждение митохондрий обозначено стрелками; головки стрелок указывают на митохондрии с концентрическими кристами. Звёздочками (*) отмечено истончение миофибрилл.

Скачать (2MB)

Метаданные

4. Рис. 3. Фрагмент цитоплазмы кардиомиоцита доношенных (а) и недоношенных (b) самцов крыс на 180-е сутки постнатального онтогенеза. Окрашивание уранил ацетатом и цитратом свинца, ×18 000 (а), ×30 000 (b). Звёздочками (*) отмечена диссоциация кластеров митохондрий в цитоплазме кардиомиоцита недоношенного животного.

Скачать (3MB)

Метаданные