Electron microscopy study of left ventricular cardiomyocytes in adult rats born preterm

全文:

Обоснование

Недоношенность является фактором риска раннего развития заболеваний сердечно-сосудистой системы [1]. В последние годы проведено множество клинических исследований, целью которых явилось установление структурных основ функциональных изменений сердца подростков и взрослых, рожденных недоношенными. Обнаружено, что у преждевременно рожденных людей в подростковом и взрослом возрасте сердце имеет более сферическую форму [2], в миокарде в большей степени, чем у доношенных сверстников, выражен интерстициальный фиброз [3, 4]. Однако, по результатам клинических исследований невозможно составить представление о гистологических и ультраструктурных особенностях миокарда преждевременно рожденных людей в подростковом и взрослом возрасте. Все вышеизложенное свидетельствует о необходимости, наряду с клиническими исследованиями, проведения экспериментальных работ, посвященных данной проблеме.

Цель

Изучить ультраструктуру кардиомиоцитов левого желудочка недоношенных на 24 ч крыс на 180 сутки постнатального онтогенеза.

Материалы и Методы

Дизайн исследования

Исследование проведено на доношенных (n=4, продолжительность беременности 22 суток) и недоношенных (n=4, продолжительность беременности 21 суток) самцах крыс Вистар. Потомство получено от интактных самцов (2 мес., 200 г) и самок (3 мес., 200 г) крыс Вистар. Животных ссаживали на ночь, утром следующего дня для верификации коитуса анализировали влагалищный мазок. День обнаружения во влагалищном мазке сперматозоидов определяли как первый день беременности. Доношенные животные получены в результате естественных, нестимулированных родов крыс. Преждевременные роды стимулировали однократной подкожной инъекцией антипрогестина мифепристона (1 мл, 10 мг/кг массы тела, Sigma-Aldrich, США) на 20 сутки беременности. Введение антипрогестинов беременным крысам приводит к началу родов через 18-24 ч [5]. Потомство до достижения месячного возраста содержали вместе с матерями. Животные содержались в стандартных условиях вивария. Размер выборки предварительно не рассчитывался.

Трансмиссионная электронная микроскопия

Крыс выводили из эксперимента на 180 сутки постнатального онтогенеза асфиксией углекислым газом, фрагменты миокарда средней трети латеральной стенки левого желудочка 24 ч фиксировали в 4%-ом параформальдегиде (Serva, Германия), далее 3 ч фиксировали образцы в 1%-ом тетраоксиде осмия (SPI, США). Фрагменты миокарда заливали в смесь смол Epon 812, Aralditе 502 и DDSA (SPI, США). Срезы толщиной 80 нм получали на ультратоме Leica ЕМ UC 7 (Leica, Австрия) и контрастировали уранил ацетатом и цитратом свинца. Ультраструктурное исследование проводили на трансмиссионном электронном микроскопе JEM-1400 (JEOL, Япония). Морфометрический анализ полученных изображений осуществляли в ImageJ 1.48 (NIH, США). На электронограммах продольных срезов сократительных кардиомиоцитов определяли относительные площади ядра, цитоплазмы, миофибрилл, митохондрий.

Морфометрическое исследование и статистический анализ

Морфометрическое исследование проведено не менее, чем 5 кардиомиоцитов для каждого животного. Количественные показатели анализировали в программе SPSS 16.0 (IBM, США). Данные описательной статистики представлены в виде медианы и квартилей – Ме(Q₁, Q₃). Проверку на нормальность распределения проводили при помощи критерия Шапиро-Уилка. Распределение не соответствует нормальному закону, поэтому для выявления различий между группами использован критерий Манна-Уитни. Уровень статистической значимости различий принят p<0,05.

Этическая экспертиза

Исследование выполнено при соблюдении Федерального Закона РФ «О защите животных от жестокого обращения» от 01.01.1997 г. Протокол исследования одобрен локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России (№ 8475/1 от 30.11.2020).

Результаты

Строение кардиомиоцитов недоношенных и доношенных крыс на 180 сутки постнатального периода принципиально схоже (рис. 1). Миокард образуют двуядерные кардиомиоциты, ядра которых овальные, расположены центрально и характеризуются преобладанием эухроматина. Однако, относительная площадь ядер кардиомиоцитов недоношенных крыс ниже, а цитоплазмы – выше, чем у доношенных животных (табл. 1). Наблюдаемые отличия связаны с развитием перинуклеарного набухания цитоплазмы в кардиомиоцитах недоношенных крыс (рис. 1, б).

Пучки миофибрилл в кардиомиоцитах недоношенных крыс ориентированы правильно, относительная площадь миофибрилл не отличается от таковой у доношенных крыс (табл. 1). В некоторых кардиомиоцитах недоношенных крыс миофибриллы истончены (рис. 2, а).

Многочисленные митохондрии в кардиомиоцитах недоношенных крыс, также как у доношенных животных, имеют субсарколеммальную, межмиофибриллярную и перинуклеарную локализацию. Относительная площадь митохондрий кардиомиоцитов недоношенных и доношенных крыс на 180 сутки постнатального онтогенеза не отличается (табл. 1). Однако, в кардиомиоцитах недоношенных крыс определяются митохондрии с повреждениями внутренней или обеих мембран (рис. 2, а). В кардиомиоците признаки повреждения выявляются в митохондриях любой локализации. Исключительно у недоношенных крыс в кардиомиоцитах обнаружены митохондрии с концентрическими кристами (рис. 2, б). Обращает на себя внимание разрозненное расположение митохондрий в цитоплазме кардиомиоцитов недоношенных крыс, в то время как в клетках доношенных животных определяются кластеры митохондрий (рис. 3).

Особенностей строения саркоплазматической сети и Т-трубочек в кардиомиоцитах недоношенных крыс на 180 сутки постнатального онтогенеза не наблюдается. Не установлено особенностей строения межклеточных контактов кардиомиоцитов недоношенных крыс на 180 сутки постнатального периода онтогенеза.

Обсуждение

На сегодняшний день ультраструктурный анализ миокарда проведен только у недоношенных детей, умерших в период новорожденности [6, 7], тогда как отдаленные эффекты преждевременного рождения на ультраструктуру кардиомиоцитов человека не описаны. Продемонстрированы не только меньшая степень дифференцировки кардиомиоцитов новорожденных недоношенных, в сравнении с таковой у доношенных детей, но и признаки повреждения кардиомиоцитов, такие как перинуклеарный отек, деструкция митохондриальных мембран [6, 7]. Влияет ли преждевременное рождение на ультраструктуру кардиомиоцитов в отдаленном постнатальном периоде онтогенеза представляется интересным вопросом.

C этой целью проведены единичные экспериментальные исследования ультраструктуры кардиомиоцитов у животных, которым моделировали недоношенность. В качестве модели недоношенности исследователями выбрана модель содержания доношенных грызунов в период новорожденности в гипероксических условиях [8]. Наше исследование проведено на рожденных на 24 ч ранее срока крысах-самцах, поскольку, по нашему мнению, феномен недоношенности заключается в первую очередь в рождении организма со структурно и функционально незрелыми органами и не может быть приравнен исключительно к эффектам гипероксии.

Нами установлены структурно-функциональные нарушения в кардиомиоцитах недоношенных животных в отдаленном постнатальном периоде онтогенеза. Наблюдаемые в кардиомиоцитах недоношенных животных деструкция митохондриальных мембран, диссоциация кластеров митохондрий, а также концентрическая организация митохондриальных крист свидетельствуют о нарушении энергопродукции в клетках. Повреждение митохондриальных мембран приводит к разобщению процессов окисления и фосфорилирования, а кроме того, к продукции активных форм кислорода. В своем исследовании K.N. Goss и соавт. продемонстрировали в отдаленном постнатальном периоде в миокарде крыс, которым моделировали недоношенность (неонатальная гипероксия), снижение активности супероксиддисмутазы 1 и 2 [8]. Повышенная продукция активных форм кислорода на фоне угнетения активности антиоксидантных ферментов может быть причиной выраженного окислительного стресса.

Причины появления митохондрий с концентрическим расположением крист не вполне изучены, однако, известно, что подобная пространственная организация крист появляется при повреждении митохондриального или ядерного генома, в том числе в результате окислительного стресса [9, 10]. На модели недоношенности, заключающейся в содержании доношенных крыс в период новорожденности в условиях гипероксии, показано выраженное повреждение митохондриального генома в кардиомиоцитах в отдаленном постнатальном периоде онтогенеза (1 год) [8]. Концентрическая организация крист митохондрий, по мнению А. Vincent и соавт., приводит к снижению эффективности энергопродукции в них [10].

В кардиомиоцитах в норме митохондрии формируют структурно-функциональные кластеры. Координированное функционирование митохондрий в пределах кластера обусловлено наличием специфических белковых межмитохондриальных контактов [11]. В кардиомиоцитах недоношенных крыс митохондрии располагаются разрозненно, не формируя межмитохондриальных контактов. Таким образом, можно сделать вывод о функциональной дискоординации митохондрий кардиомиоцитов недоношенных животных. Одной из причин диссоциации митохондрий из кластера является их повреждение. Известно также, что в состав кластера не входят также делящиеся и новообразованные митохондрии [11].

Наблюдаемые в кардиомиоцитах преждевременно рожденных крыс истончение миофибрилл и набухание перинуклеарной цитоплазмы могут быть следствием как энергодефицита, так и повреждения активными формами кислорода.

Таким образом, у преждевременно рожденных крыс в отдаленном постнатально периоде, также как у недоношенных новорожденных детей [6, 7], в кардиомиоцитах наблюдаются набухание цитоплазмы и повреждение митохондрий. Следовательно, можно сделать вывод о длительных стереотипных ультраструктурных нарушениях в кардиомиоцитах, вызванных преждевременным рождением. Примечательно, что в отдаленном постнатальном периоде у людей, рожденных недоношенными, также продемонстрированы признаки нарушения энергетического метаболизма. В возрасте 25-26 лет в моноцитах людей, рожденных недоношенными, показано увеличение активности митохондриального окисления, но снижение эффективности продукции АТФ [12].

Заключение

Преждевременное рождение оказывает длительные эффекты на ультраструктуру кардиомиоцитов. Наблюдаемые ультраструктурные изменения свидетельствуют о нарушении энергопродукции в кардиомиоцитах недоношенных крыс в отдаленном постнатальном периоде онтогенеза.

Таблица 1. Относительная площадь ультраструктур кардиомиоцитов крыс

Table 1. Relative area of rat cardiomyocytes ultrastructures

Примечание: * отличие от показателя крыс контрольной группы; р – уровень значимости

Рис. 1. Миокард левого желудочка доношенных (а) и недоношенных (b) самцов крыс, 180 сутки постнатального онтогенеза. Уранил ацетат и цитрат свинца, ×20000 (а), ×12000 (b). Перинуклеарное набухание цитоплазмы (*) кардиомиоцита недоношенного животного.

Рис. 2. Фрагмент цитоплазмы кардиомиоцита недоношенных самцов крыс (а, b), 180 сутки постнатального онтогенеза. Повреждение митохондрий (стрелка). Митохондрии с концентрическими кристами (головка стрелки). Истончение миофибрилл (*).

Рис. 3. Фрагмент цитоплазмы кардиомиоцита доношенных (а) и недоношенных (b) самцов крыс, 180 сутки постнатального онтогенеза. Уранил ацетат и цитрат свинца, ×60000 (а), ×30000 (b). Диссоциация кластеров митохондрий в цитоплазме кардиомиоцита недоношенного животного (*).

Дополнительная информация

Источник финансирования. Исследование проведено при поддержке Российского научного фонда (проект № 24-25-00015).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. В.В. Иванова — проведение эксперимента, сбор и анализ литературных источников, написание текста и редактирование статьи; И.В Мильто — проведение эксперимента, редактирование статьи. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

Благодарности. Авторы выражают признательность ведущему инженеру ЦКП ИФПМ СО РАН «НАНОТЕХ», к.ф.-м.н Миллеру Андрею Александровичу и заведующей Группой микроскопических исследований ИХБФМ СО РАН, д.б.н., профессору Рябчиковой Елене Ивановне за возможность проведения электронномикроскопического исследования на современном оборудовании.

作者简介

Vera Ivanova

编辑信件的主要联系方式.
Email: ivvera92@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0002-2530-1112
SPIN 代码: 9476-3329
Scopus 作者 ID: 55265928000
Researcher ID: O-4180-2016

кандидат биологических наук, доцент кафедры морфологии и общей патологии

参考

补充文件