Особенности эпиморфной регенерации дистальной фаланги пальца у иглистых мышей (Acomys cahirinus)



Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Доступ платный или только для подписчиков

Аннотация

Обоснование. Восстановление концевой фаланги пальца представляет собой редкий пример полноценной регенерации без развития фиброза у взрослых млекопитающих. Иглистые мыши рода Acomys способны к восстановлению многих тканей, включая эпидермис, мышцы и др. без формирования рубца. Способность A. cahirinus к полноценному восстановлению концевой фаланги пальца не известна.

Цель — оценка динамики восстановления концевой фаланги пальца после ампутации у иглистых мышей.

Методы. Динамику регенерации концевых фаланг пальцев у грызунов M. Musculus и A.cahirinusоценивали в течение 28 дней после ампутации. Для моделирования эпиморфной регенерации посредством формирования бластемы ампутацию концевой фаланги проводили дистальнее ногтевого ложа. Для моделирования повреждения, завершающегося формированием фиброзного рубца, ампутацию проводили проксимальнее ногтевого ложа. Восстановление оценивали с помощью визуального анализа, микрокомпьютерной томографии и гистологического исследования.

Результаты. В отличие от M.musculus, демонстрирующих полноценное восстановление всего комплекса тканей концевой фаланги пальца, у A. cahirinus ампутация не приводит к полноценному восстановлению. У этих животных в результате ампутации концевой фаланги пальца дистальнее ногтевого ложа происходило укорочение пальцев и их деформация по типу «барабанных палочек». Гистологический анализ показал гипертрофию костей поврежденной фаланги у иглистых мышей. С помощью микрокомпьютерной томографии установлено, что поврежденная в результате ампутации кость фаланги подвергается лизису вплоть до полной деградации, а гипертрофия происходит в кости пальца следующей фаланги, расположенной проксимальнее плоскости ампутации.

Заключение. Полноценного восстановления тканей концевой фаланги, включая кость, у A. сahirinusпосле ампутации не происходит. Возможно, это обусловлено чрезмерным лизисом культи поврежденной кости, а также недостаточным формированием бластемы в участке повреждения.

Полный текст

ОБОСНОВАНИЕ

Фиброз является одним из самых серьезных отложенных неблагоприятных исходов восстановления ткани после повреждения или хирургического вмешательства. Поэтому поиск механизмов, препятствующих развитию фиброза, а также способствующих его замедлению и разрешению, является актуальнейшей медицинской задачей.

У большинства млекопитающих, включая человека, редким примером комплексной регенерации тканей без развития фиброза является восстановление дистального фрагмента концевой фаланги пальца. Ампутация кончика фаланги дистальнее ногтевого ложа вызывает специализированную реакцию заживления ран, заканчивающуюся образованием массы недифференцированных пролиферирующих клеток (бластемы) [1]. Для этого процесса необходимы закрытие участка повреждения раневым эпидермисом, частичная деградация тканей культи иммунными клетками и утрата специализации клетками регенерирующих тканей, которая происходит под влиянием молекулярных сигналов клеток ногтевого ложа [2, 3]. Формирование бластемы завершается дифференцировкой ее клеток во множество типов, составляющих регенерирующие ткани. В результате происходит полное восстановление всего комплекса тканей концевой фаланги пальца, включая кость, мышцы, жировую ткань и эпидермис [4]. В случае ампутации выше (проксимальнее) ногтевого ложа формирования бластемы не происходит, а восстановление фаланги происходит по репаративному типу, с отложением плотной слоистой фиброзной рубцовой ткани [5].

Иглистые мыши (животные рода Acomys) представляют собой перспективную модель для изучения механизмов предотвращения фиброза, поскольку способны к полноценному восстановлению тканей, включая обширные фрагменты кожи, миокард и почки, без замещения рубцовой тканью. Регенерации тканей у иглистых мышей в большинстве случаев предшествует формирование бластемы [6, 7]. 

Мы предположили, что у A.cahirinus восстановление фаланги пальца после ампутации дистальнее ногтевого ложа будет происходить быстрее, чем у M.musculus. Мы также предположили, что ампутация проксимальнее ногтевого ложа, которая у M.musculus приводит к репаративному ответу и фиброзу, у A.cahirinus может завершиться полноценной регенерацией.

ЦЕЛЬ

Целью исследования была сравнительная оценка динамики восстановления концевой фаланги пальца после ампутации у иглистых мышей (A.cahirinus) и домовой мыши (M.musculus)

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Дизайн исследования

В данном исследовании мы использовали модель регенерации фаланги пальца после ампутации. Исследование проведено на мышах M.musculus линии С57/B6 и A.cahirinus (самки, возраст 8-16 недель), собственного разведения лаборатории трансляционной медицины факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова. Животных наркотизировали смесью изофлурана (2% изофлурана 93% О2), подаваемой с помощью концентратора V3000 Parkland Scientific with Oxygen Concentrator Nuvo Lite 525. Под наркозом выполняли ампутацию концевых фаланг 2, 3 и 4 пальцев задних конечностей на уровнях дистальнее или проксимальнее ногтевого ложа, как было описано ранее [5]. Через 3, 7, 10, 14, 21 и 28 дней после ампутации животных эвтаназировали в СО2-камере, а поврежденные пальцы анализировали с помощью стереомикроскопа (Leica MZ95) и микрокомпьютерной томографии, а также гистологического окрашивания. Все процедуры с животными были одобрены комиссией по биоэтике МГУ (заявка №3.5-сод, одобрена на заседании №141-д-з от 17.03.2022).

Микрокомпьютерная томография

Трехмерные изображения костей пальцев через 3, 7, 10, 14, 21 и 28 дней после повреждения были получены с помощью томографа MiLabs VECTOR 6 (Нидерланды). Сканирование проводили в режиме «Ultra focus», используя следующие параметры: напряжение 55 кВ, сила тока 0,21 мА, время экспозиции в одной плоскости 75 мсек, угол поворота источника 0,2°. Реконструкцию изображений проводили с помощью программного обеспечения MiLabs Rec 12.00 (Нидерланды) с размером вокселя 20 мкм. Обработку и анализ изображений проводили с использованием программного обеспечения RadiAnt DICOM Viewer 2024.1 (Польша).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Ампутация дистального фрагмента концевой фаланги у иглистых мышей не завершается полноценным восстановлением ногтевого ложа и ногтя

 

После ампутации фрагмента концевой фаланги пальца дистальнее ногтевого ложа у M.musculus были выявлены классические стадии и этапы, описанные ранее, а именно закрытие раневой поверхности, формирование бластемы с дальнейшим полным или частичным восстановлением всех структур кончика пальца вплоть до отрастания ногтя к 28 дню (риc.1). У A.cahirinus после ампутации ранозаживление происходит по иному сценарию. Закрытие раны занимает более продолжительное время по сравнению с M.musculus, и даже к 14 дню можно наблюдать незатянувшуюся рану (рис.1). Позднее у иглистых мышей можно наблюдать укорочение пальцев и их деформацию с формированием «барабанных палочек». При этом полного восстановления структур кончика пальца не происходит, о чем можно судить по отсутствию отросшего ногтя через 28 дней после ампутации (ДПА) при визуальной оценке. Восстановления дины пальцев не происходит и на более поздних сроках, вплоть до 56 дней наблюдения.

Гистологический анализ сагиттальных срезов пальцев также показал, что через 28 ДПА у A.сahirinusнарушена структура концевой фаланги, за счет замещения большей части ее объема гипертрофированной костью. При этом у M.musculus через 28 ДПА соотношение тканей концевой фаланги практически полностью соответствует интактной. Следует отметить, что структура кости у A. cahirinus соответствует зрелой костной ткани с упорядоченными костными пластинками, тогда как у M. musculus новая регенерировавшая кость представлена незрелой тканью, плохо поддающейся декальцификации. На этом сроке наблюдения на гистологических препаратах, так же, как и при визуальной оценке, у M. musculus хорошо виден отрастающий ноготь, по структуре и форме соответствующий интактному. В большинстве случаев у A.сahirinus отрастание ногтя, соответствующего интактному, не отмечается. Однако следует отметить, что поверхность регенерирующей фаланги у некоторых иглистых мышей через 28 ДПА покрыта слоем неплотно прилегающего соединительнотканного вещества, по свойствам светопреломления и толщине сходного с ногтевой пластиной.

 

У иглистых мышей ампутация вызывает интенсивный лизис костной культи

Для оценки изменений костей пальца после ампутации фрагмента дистальной фаланги, мы провели анализ пальцев с помощью микрокомпьютерной томографии. У домовых мышей ампутация дистального фрагмента концевой фаланги вызывала частичный лизис костной культи, часто с формированием секвестра (рис. 2) через 14 ДПА.  Однако через 28 ДПА на снимках микроКТ можно наблюдать восстановление кости третьей фаланги по форме соответствующую интактной, с лакуной костного мозга, что полностью воспроизводит опубликованные ранее данные.

У иглистых мышей лизис костной культи оказался намного более выраженным и, по-видимому, происходил вплоть до полной деградации кости третьей фаланги (рис. 3, 4). Через 28 ДПА на микроКТ кость третьей фаланги часто полностью отсутствует (рис. 4), но отмечается значительное утолщение кости второй фаланги (рис. 3). Это наблюдение хорошо соотносится с результатами гистологического анализа, который показал формирование новой кости у M.musculus, а у A.cahirinus – увеличение объема уже существующей.

При ампутации пальца на уровне второй фаланги у М.musculus не происходит изменения объема костной культи – ни видимого лизиса, ни восстановления (рис. 2). Однако у иглистых мышей, как и в случае ампутации дистальной части кости третьей фаланги, ампутация на уровне второй также приводила к интенсивному гистолизису костной культи, вплоть до полной деградации поврежденной кости (рис. 3).

ОБСУЖДЕНИЕ

Резюме основного результата исследования

В исследовании впервые продемонстрирована динамика регенерации дистальной фаланги пальца у иглистых мышей. Вопреки ожиданиям ускоренной регенерации по сравнению с M. musculus, мы обнаружили, что полноценного восстановления концевой фаланги у A. сahirinus не происходит вовсе. Вместо этого происходит деградация поврежденной кости и гипертрофия кости фаланги проксимальнее плоскости ампутации.

Обсуждение основного результата исследования

Недостаточное формирование бластемы после ампутации дистального фрагмента концевой фаланги пальца у A.сahirinus стало неожиданным наблюдением, поскольку ранее было отмечено, что формирование бластемы сопровождает восстановление ушной раковины, миокарда и почки у этих животных. В качестве причин т.н. «некомпетентной регенерации» конечностей рассматриваются 3 основных механизма: «эпителиальная некомпетентность», «мезенхимная некомпетентность» и нарушение функционирования иммунных клеток [8]. Эпителиальная некомпетентность состоит в недостаточном или несвоевременном формировании раневого эпидермиса. Даже у амфибий, для которых характерно полноценное восстановление конечности после ампутации, удаление раневого эпидермиса либо подавление его формирования полностью блокировало регенерацию конечности [9]. Раневой эпидермис является источником сигналов, стимулирующих миграцию клеток в область формирования бластемы. Эта структура также создает локальную гипоксию, которая способствует поддержанию клеток бластемы в недифференцированном состоянии [10]. В данном исследовании мы обнаружили, что у A.сahirinus раневая поверхность длительное время остается открытой, что может препятствовать формированию бластемы.

«Мезенхимная некомпетентность» для тканей взрослых млекопитающих состоит в неспособности клеток фибробластического ряда к частичной утрате специализации – дедифференцировке. Однако ранее и на модели регенерации ушной раковины, и на модели восстановления эпидермиса ранее было показано, что клетки фибробластического ряда у A.сahirinus способны к смене фенотипа, причем даже более быстрой по сравнению с M.musculus. Поэтому данный механизм, по-видимому, не является причиной недостаточной регенерации концевых фаланг пальцев у иглистых мышей.

Для формирования бластемы необходимо участие иммунных клеток, прежде всего макрофагов [11]. Именно макрофаги обеспечивают частичную деградацию тканей культи, включая кость. Считается, что такое расщепление внеклеточного матрикса приводит к высвобождению прогениторных клеток, участвующих в формировании бластемы, а также облегчает их миграцию в область регенерации. Макрофаги и их предшественники, моноциты, являются источником остеокластов – специализированных клеток, разрушающих кость. По-видимому, наблюдаемый нами лизис культи кости обусловлен быстрым накоплением остеокластов, который приводит к избыточному разрушению кости. При этом неизвестно, как влияет такая активность макрофагов на другие ткани культи. Например, происходит ли их деградация вплоть до полного «опустошения» регенеративно компетентными клетками?

Полученные нами данные также свидетельствуют о том, что для регенерации кости обязательным условием является сохранение ее части, то есть не полная деградация, поскольку при полной деградации культи инициации формирования новой кости не происходит.

Наблюдаемое утолщение кости фаланги проксимальнее участка повреждения происходит, по-видимому, благодаря активности присутствующих в ней остеопрогениторных клеток. Однако детальные механизмы этого явления у A.сahirinus требуют дальнейшего выяснения.

Ограничения исследования

Существенным ограничением исследования является отсутствие оценки клеточной динамики в регенерирующей фаланге у A.сahirinus, что не позволяет достоверно описать клеточные реакции, ответственные как за остеолизис, так и за формирование бластемы.  

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полноценного восстановления тканей концевой фаланги, включая кость, у A. сahirinus после ампутации не происходит. Возможно, это обусловлено как недостаточным формированием бластемы в участке повреждения, так и чрезмерной деградацией культи поврежденной кости.

Рис. 1. Дистальный отдел задних конечностей M. musculus (нижнй ряд) и A. сahirinus (верхний ряд) через 7, 14, 21 и 28 ДПА 2, 3 и 4 пальцев.   

Рис. 2. Томографическая визуализация костей фаланг пальца M. musculus, 0, 3, 14 и 28 ДПА. Верхний ряд – ампутация фрагмента концевой фаланги проведена выше (дистальнее) ногтевого ложа. Заметно уменьшение объема культи поврежденной кости третьей фаланги через 14 ДПА и восстановление ее формы и структуры через 28 ДПА. Нижний ряд - ампутация фрагмента концевой фаланги проведена ниже (проксимальнее) ногтевого ложа.

Рис. 3. Томографическая визуализация костей фаланг пальца A. cahirinus, 0, 3, 14 и 28 ДПА. Верхний ряд – ампутация фрагмента концевой фаланги проведена выше (дистальнее) ногтевого ложа. Заметно уменьшение объема культи поврежденной кости третьей фаланги через 14 ДПА, вплоть до ее полной деградации через 28 ДПА. Нижний ряд - ампутация фрагмента концевой фаланги проведена ниже (проксимальнее) ногтевого ложа. Также заметно уменьшение объема культи поврежденной кости второй фаланги через 14 ДПА, вплоть до ее полной деградации через 28 ДПА.

Рис. 4. Сравнительный анализ длин дистальных фаланг у M. musculus и A. сahirinus через 0, 3, 7, 10, 14, 21, 28, 42 и 56 ДПА.

 

×

Об авторах

Юлия Георгиевна Антропова

МГУ имени М.В. Ломоносова

Email: Julia.g.antropova@gmail.com
ORCID iD: 0009-0008-8120-5548
SPIN-код: 6044-6339

к.б.н., снс, лаб.генных и клеточных технологий, 

каф.биохимии и регенеративной медицины, 

МНОИ ФФМ, МГУ им. М.В. Ломоносова
Россия, Ленинские горы, д.1, 119234, г. Москва, Россия

Алена Александровна Шилова

МГУ имени М.В. Ломоносова

Email: ladybird-a@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0004-6774-6306

лаборант лаб. трансляционной медицины

ФФМ МГУ имени М.В. Ломоносова

Ленинские горы, д.1, 119234, г. Москва, Россия

Роман Юрьевич Еремичев

МГУ имени М.В. Ломоносова

Email: eremichevry@my.msu.ru
SPIN-код: 6245-1180

м.н.с. лаб. генно-клеточной терапии

Центра регенеративной медицины МНОИ

МГУ имени М.В. Ломоносова

Россия, Ленинские горы, д.1, 119234, г. Москва, Россия

Всеволод Андреевич Скрибицкий

Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Блохина

Email: skvseva@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2942-7895
SPIN-код: 8568-6890

младший научный сотрудник

Россия, 115478, Москва, Каширское шоссе, д. 23

Кристина Евгеньевна Шпакова

Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Блохина

Email: shpakova.k.e@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-0246-1794
Россия, 115478, Москва, Каширское шоссе, д. 23

Юлия Андреевна Финогенова

Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Блохина; Российский университет дружбы народов имени Патриса Лумумбы

Email: b-f.finogenova@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5144-1039
SPIN-код: 7597-2604

научный сотрудник

Россия, 115478, Москва, Каширское шоссе, д. 23; Москва

Антон Андреевич Касьянов

Национальный исследовательский ядерный университет «МИФИ»

Email: a_kasianov@mail.ru
ORCID iD: 0009-0004-0248-9126

Ассистент, кафедра медицинской физики (№35) инженерно-физического института биомедицины НИЯУ МИФИ

Россия, 115409, Москва, Каширское шоссе, 31, Россия

Алексей Андреевич Липенгольц

Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Блохина

Email: lipengolts@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5631-9016
SPIN-код: 9822-6359

кандидат физ.-мат. наук, ведущий научный сотрудник

Россия, 115478, Москва, Каширское шоссе, д. 23

Владимир Сергеевич Попов

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: galiantus@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-5039-7152
SPIN-код: 3276-5620

заведующий лабораторией трансляционной медицины, кандидат биологических наук.

Россия, Российская Федерация, 1 19991, Москва, ул. Ленинские горы, д. 1

Павел Игоревич Макаревич

ФГБОУ ВО «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»

Email: makarevichpi@my.msu.ru
ORCID iD: 0000-0001-8869-5190
SPIN-код: 7259-9180

Доктор медицинских наук, заведующий лабораторией генно-клеточной терапии ЦРМ МНОИ

МГУ имени М.В. Ломоносова

Россия, Ленинские горы, д.1, 119234, г. Москва, Россия

Наталья Игоревна Калинина

МГУ им. М.В. Ломоносова

Автор, ответственный за переписку.
Email: n_i_kalinina@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3497-9619
SPIN-код: 6300-6946

кандидат биологических наук, доцент кафедры биохимии и молекулярной медицины ФФМ МНОИ 

МГУ имени М.В. Ломоносова

Россия, Ленинские горы, д.1, 119234, г. Москва, Россия

Список литературы

  1. 1. Wound healing and blastema formation in regenerating digit tips of adult mice / W.A. Fernando, E. Leininger, J. Simkin [et al.] // Dev Biol. – 2011. – V. 350. – №. 2. – P. 301-310.
  2. 2. Mammalian Digit Tip Regeneration: Moving from Phenomenon to Molecular Mechanism / G.L. Johnson, J.A. Lehoczky // Cold Spring Harb Perspect Biol. – 2022. – V. 14. – №. 1. –
  3. 3. Initiation of limb regeneration: the critical steps for regenerative capacity / H. Yokoyama // Dev Growth Differ. – 2008. – V. 50. – №. 1. – P. 13-22.
  4. 4. Limb regeneration in higher vertebrates: developing a roadmap / M. Han, X. Yang, G. Taylor [et al.] // Anat Rec B New Anat. – 2005. – V. 287. – №. 1. – P. 14-24.
  5. 5. Level-specific amputations and resulting regenerative outcomes in the mouse distal phalanx / C.S. Chamberlain, J.J. Jeffery, E.M. Leiferman [et al.] // Wound Repair Regen. – 2017. – V. 25. – №. 3. – P. 443-453.
  6. 6. Model systems for regeneration: the spiny mouse, Acomys cahirinus / M. Maden, J.A. Varholick // Development. – 2020. – V. 147. – №. 4. – P. dev167718.
  7. 7. The blastema and epimorphic regeneration in mammals / A.W. Seifert, K. Muneoka // Developmental biology. – 2018. – V. 433. – №. 2. – P. 190-199.
  8. 8. Multi-species atlas resolves an axolotl limb development and regeneration paradox / J. Zhong, R. Aires, G. Tsissios [et al.] // Nat Commun. – 2023. – V. 14. – №. 1. – P. 6346.
  9. 9. Limb regeneration / A. Simon, E.M. Tanaka // Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. – 2013. – V. 2. – №. 2. – P. 291-300.
  10. 10. Wound epidermis formation and function in urodele amphibian limb regeneration / L.J. Campbell, C.M. Crews // Cell Mol Life Sci. – 2008. – V. 65. – №. 1. – P. 73-79.
  11. 11. Macrophages are necessary for epimorphic regeneration in African spiny mice / J. Simkin, T.R. Gawriluk, J.C. Gensel [et al.] // Elife. – 2017. – V. 6.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© Эко-Вектор,


Периодический печатный журнал зарегистрирован как СМИ Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор): № 0110212 от 08.02.1993.
Сетевое издание зарегистрировано как СМИ Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор): ЭЛ № ФС 77 - 84733 от 10.02.2023.