Функциональная морфология мукоцилиарной транспортной системы бронхов у крыс в постнатальном онтогенезе

Полный текст

ОБОСНОВАНИЕ

Многорядный столбчатый реснитчатый (респираторный) эпителий обеспечивает эффективное функционирование мукоцилиарной транспортной системы (МЦТС) воздухоносных путей. Формирование и перемещение слизи по внутренней поверхности бронхов и трахеи происходит за счёт скоординированной работы цилиарного аппарата реснитчатых клеток и секреторных железистых элементов [1, 2]. Возрастные перестройки эпителиального пласта, сопровождающиеся изменениями его барьерной и транспортной функций, могут играть существенную роль в патогенезе респираторных заболеваний [3, 4]. Особенности микроскопической структуры и двигательной активности эпителия воздухоносных путей на различных этапах постнатального развития достаточно подробно изучены в области верхних дыхательных путей [2, 5] и в гораздо меньшей степени — в бронхиальном дереве [6]. Как правило, при изучении бронхов авторы используют ограниченный набор временных контрольных точек, а применяемые методы оценки цилиарной активности существенно различаются, что затрудняет сопоставление результатов. Кроме того, отсутствуют экспериментальные исследования динамики количественных показателей структуры и функции эпителиальной выстилки бронхов на протяжении всего постнатального онтогенеза, выполненные в стандартных условиях с использованием единых методических подходов.

Цель исследования — изучить возрастные закономерности постнатального морфогенеза мукоцилиарной транспортной системы бронхов у крыс на основе структурно-функционального анализа элементов респираторного эпителия.

МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Проведено наблюдательное одноцентровое одномоментное выборочное неконтролируемое исследование на лабораторных животных.

Критерии соответствия

Интактные самцы крыс линии Вистар с известной датой рождения. Группы животных, достигших необходимого для исследования возраста, формировали случайным образом. Крыс выращивали в условиях вивария, соответствующих ГОСТ 33215-2014 от 07.01.2016 г. и ГОСТ 33216-2014 для данного вида животных. Животных содержали при постоянном свободном доступе к воде и специализированному сухому корму (АПК «Стойленская нива», Россия).

Условия проведения

Исследование проведено на базе кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии ФГБОУ ВО ЯГМУ Минздрава России (проведение экспериментов, гистологические и иммуногистохимические исследования), Центра коллективного пользования электронной микроскопии Института биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН (трансмиссионная электронная микроскопия [ТЭМ]) и Ярославского филиала Физико-технологического института РАН (низковакуумная сканирующая электронная микроскопия [СЭМ]).

Продолжительность исследования

Исследование проведено в период с 2017 по 2024 год. В первые 3 года выращивали крыс, осуществляли сбор биологического материала на различных этапах постнатального развития (1, 8, 14 суток, 1, 3, 6, 14, 20 и 26 месяцев после рождения), а также гистологическую и морфометрическую обработку образцов. В 2023 году выполнены исследования образцов бронхов с помощью ТЭМ и СЭМ, а также проведён заключительный анализ результатов. В 2024 году — подготовлена рукопись статьи.

Описание медицинского вмешательства

Материал для исследования получали после внутримышечного введения животным смеси тилетамина и золазепама (препарат Золетил 100®; Virbac, Франция) в дозе 10 мг/кг. Правое лёгкое использовали для прижизненного исследования, фрагменты левого лёгкого — для гистологического анализа. Эвтаназию проводили до пробуждения крыс методом декапитации. Морфологический и функциональный анализ выполняли отдельно для главных (ГБ), долевых (ДБ) и сегментарных бронхов (СБ)

Прижизненные наблюдения. Двигательную активность цилиарного аппарата определяли на тонких (до 1 мм) фрагментах лёгких по модифицированной методике, подробно описанной ранее [7]. Использовали программно-аппаратный комплекс НПО «Азимут-4» (Россия), включающий микроскоп Биомед-2 вар. 3 (АО «ЛОМО», Россия) с электронным блоком термостатирования, высокочастотную цифровую видеокамеру Grasshopper 3 2.3 MP Color USB3 Vision (FLIR Integrated Imaging Solutions Inc., Канада) и персональный компьютер со специализированным программным обеспечением MOSFRO (v.4). (НПО «Азимут-4», Россия).

Световая микроскопия. Фрагменты лёгких фиксировали в 10% нейтральном формалине (ООО «Элемент», Россия) и заливали в парафин (Deltalab, Испания), срезы толщиной 4–5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином (Emmonya Biotech Ltd, Болгария) и реактивом Шиффа (Labiko, Россия) с докраской гематоксилином.

Иммуногистохимическое выявление маркера клеточной пролиферации — белка Ki-67, выполняли на парафиновых срезах с использованием моноклональных кроличьих антител (Ventana Medical Systems, США; каталожный номер 790-4286; разведение 1/100) и системы детекции ultraView Universal DAB Detection Kit (Ventana Medical Systems, США).

Электронная микроскопия. Для ТЭМ образцы фиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида (EMS, США), постфиксировали в 1% растворе четырёхокиси осмия (ОАО «Аурат», Россия), обезвоживали в ацетоне и заливали в эпон (Sigma-Aldrich, США). Ультратонкие срезы получали на ультратоме Leica-EMU6C (Leica Microsystems, Германия), контрастировали уранилацетатом (Sigma-Aldrich, США) и просматривали на трансмиссионном электронном микроскопе JEM-1011 (JEOL Ltd, Япония), изображения оцифровывали. Для проведения СЭМ фрагменты лёгких фиксировали в 2,5% глутаровом альдегиде (EMS, США) и изучали с помощью сканирующего электронного микроскопа Quanta 3D 200i (FEI Company, США) в режиме низкого вакуума при давлении водяных паров 70–130 Па.

Основной исход исследования

Конечной точкой исследования стало определение морфометрических и функциональных характеристик клеток эпителия бронхиального дерева крыс на протяжении всего постнатального онтогенеза.

Анализ в группах

Распределение животных на возрастные группы проводили в соответствии с периодизацией постнатального развития крыс, которую предложили И.П. Западнюк и соавт. [8]: 1 сутки — новорождённые; 8 и 14 суток — подсосный период; 1 месяц — инфантильные животные; 3 месяца — ювенильные животные; 6 месяцев — молодые; 14 месяцев — взрослые; 20 месяцев — предстарые и 26 месяцев — старые крысы.

Методы регистрации исходов

Прижизненные наблюдения. Количественную обработку видеоизображений проводили с помощью прикладной программы MOSFRO (v.4), обеспечивающей автоматический расчёт частоты биения ресничек (ЧБР, Гц), а также длительности фаз эффективного и восстановительного удара ресничек (мс) [7].

Морфометрия. Процентное содержание основных морфологических типов эпителиоцитов в пласте рассчитывали на основании подсчёта 1000 клеток у каждого животного. Единицей наблюдения для последующих статистических расчётов являлось одно животное. Относительное количество Ki-67-положительных клеток определяли на основании подсчёта 500–1000 клеток у каждого животного. Для расчёта частотных показателей использовали прикладную программу «Универсальный гистологический счётчик 2.0»¹. Определение длины ресничек проводили на цифровых изображениях с помощью программы ImageJ [9] при суммарном увеличении ×1000, измеряли по 100 реснитчатых клеток у каждого животного.

Статистический анализ

Принципы расчёта размера выборки. Размер выборки предварительно не рассчитывался.

Методы статистического анализа данных. Статистическую обработку проводили с помощью пакетов прикладных программ Microsoft Office Excel 2019 (Microsoft, США) и Statistica 8.0 (StatSoft Inc., США). Нормальность распределения значений показателей проверяли с помощью теста Шапиро–Уилка, равенство дисперсий подтверждали с помощью F-теста. Количественные данные представлены в виде средней арифметической величины (M) и стандартной ошибки среднего (m). Для характеристики индивидуальной вариабельности при описании результатов приведены минимальные и максимальные средние значения показателей, рассчитанные по множественным измерениям в трёх отделах бронхиального дерева в каждой временной точке. Для определения значимости различий между выборками использовали t-критерий Стьюдента для независимых выборок, различия считали статистически значимыми при p <0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Объекты исследования

Работа выполнена на 76 самцах крыс линии Вистар без внешних признаков заболеваний, с точно известной датой рождения. Для прижизненного и гистологического исследований использовали фрагменты главных, долевых и сегментарных бронхов животных разного возраста: 1 сутки (n=9), 14 суток (n=6), 1 месяц (n=6), 3 месяца (n=6), 6 месяцев (n=9), 14 месяцев (n=8), 20 месяцев (n=6) и 26 месяцев (n=5). СЭМ-исследование проведено на 3 образцах бронхов разного калибра у крыс в возрасте 1, 8, 14 суток и 1 месяц (всего 12 животных). ТЭМ-исследование выполнено на 3 образцах бронхов разного калибра у крыс в возрасте 1 сутки, 6 и 26 месяцев (всего 9 животных).

Основные результаты исследования

Особенностью гистологической структуры бронхиального дерева крыс является отсутствие подслизистых желёз, что делает их удобной моделью для изучения субпопуляций двигательных (реснитчатые эпителиоциты), секреторных (бокаловидные клетки) и камбиальных (базальные клетки) элементов МЦТС в составе единого эпителиального пласта.

Бронхиальное дерево новорождённых крыс во всех отделах выстлано однослойным эпителием, состоящим преимущественно из недифференцированных (промежуточных) клеток, реснитчатые клетки встречаются в небольшом количестве (рис. 1, a–c). В течение двух недель после рождения доля реснитчатых клеток в эпителиальном пласте значительно увеличивается в результате активных процессов дифференцировки (цилиогенеза). Одновременно пропорционально снижается содержание малодифференцированных элементов. На апикальных полюсах дифференцирующихся реснитчатых клеток можно наблюдать разные этапы формирования ресничек (рис. 1, d, e). Созревание реснитчатых клеток происходит группами, это отчётливо видно при сканирующей электронной микроскопии (рис. 1, f). Типичная структура многорядного мерцательного эпителия формируется к концу первого месяца после рождения.

Рис. 1. Эпителиальная выстилка бронхов крыс: а — главного бронха, b — долевого бронха, c–e — сегментарных бронхов у новорождённых; f — сегментарного бронха у крыс в возрасте 8 суток. 1 — реснитчатые, 2 — щёточные (безреснитчатые), 3 — базальные клетки. Трансмиссионная электронная микроскопия, а–c — увеличение ×5000, d, e — ×8000; f — сканирующая электронная микроскопия, увеличение ×4500.

Fig. 1. Bronchial epithelial lining in rats: a, main bronchus; b, lobar bronchus; c–e, segmental bronchi in newborns; f, segmental bronchus in 8-day-old rats. 1, ciliated cells; 2, brush (non-ciliated) cells; 3, basal cells. Transmission electron microscopy: a–c, ×5000; d, e, ×8000; f, scanning electron microscopy, ×4500.

В составе дефинитивного эпителиального пласта половозрелых животных (6 месяцев) преобладают реснитчатые эпителиоциты, субпопуляции бокаловидных и базальных клеток представлены в меньшем количестве, безреснитчатые (промежуточные) клетки также относительно немногочисленны (рис. 2, a, b). На апикальной поверхности реснитчатых эпителиоцитов отчётливо видны многочисленные дифференцированные реснички (рис. 2, c). У стареющих и старых животных (20 и 26 месяцев) эпителий в полной мере сохраняет дифференцированную структуру с хорошо развитым цилиарным аппаратом (рис. 2, d, e). Однако у крыс этих возрастных групп регулярно встречаются гипертрофированные реснитчатые клетки и обнаруживаются элементы с ультраструктурными признаками повреждения — нарушением структуры органелл и вакуолизацией цитоплазмы, а также появляются участки межклеточного отёка (рис. 2, f).

Рис. 2. Эпителиальная выстилка бронхов у крыс: в возрасте 6 месяцев а — главного бронха, b — сегментарного бронха; в возрасте 26 месяцев c — сегментарного бронха, d–f — главных бронхов. 1 — реснитчатые, 2 — бокаловидные, 3 — щёточные (безреснитчатые), 4 — базальные клетки, 5 — гипертрофированная реснитчатая клетка, 6 — участки межклеточного отёка, 7 — эпителиоцит с морфологическими признаками повреждения. Трансмиссионная электронная микроскопия, а, b, e, f — увеличение ×5000, c, d — ×10000.

Fig. 2. Bronchial epithelial lining in rats: at 6 months of age, a, main bronchus; b, segmental bronchus; at 26 months of age, c, segmental bronchus; d–f, main bronchi. 1, ciliated cells; 2, goblet cells; 3, brush (non-ciliated) cells; 4, basal cells; 5, hypertrophic ciliated cell; 6, areas of intercellular edema; 7, epithelial cell with morphological signs of damage. Transmission electron microscopy: a, b, e, f, ×5000; c, d, ×10000.

Возрастная динамика количественных характеристик эпителия бронхов разного калибра представлена в табл. 1 и 2. При оценке процентного содержания основных клеточных типов с использованием световой микроскопии выделяли реснитчатые, бокаловидные, базальные и промежуточные (вставочные) клетки.

Таблица 1. Количественные показатели строения и функции мукоцилиарного аппарата бронхов у крыс в постнатальном онтогенезе — реснитчатые клетки

Table 1. Quantitative parameters of the structure and function of the bronchial mucociliary apparatus in rats during postnatal ontogenesis: ciliated cells

Примечание. Данные приведены как M±m, где М — среднее арифметическое, m — стандартная ошибка среднего; ¹ р <0,05, ² р <0,01, ³ р <0,001 по сравнению с предыдущей возрастной группой для бронхов того же типа; * р <0,05, ^& р <0,01, ^# р <0,001 по сравнению с бронхами главного типа.

Таблица 2. Количественные показатели строения и функции мукоцилиарного аппарата бронхов у крыс в постнатальном онтогенезе — содержание бокаловидных, базальных и промежуточных клеток в эпителиальном пласте

Table 2. Quantitative parameters of the structure and function of the bronchial mucociliary apparatus in rats during postnatal ontogenesis: composition of goblet, basal, and intermediate cells as the main epithelial cell types in the epithelial layer

Примечание. Данные приведены как M±m, где М — среднее арифметическое, m — стандартная ошибка среднего; ¹ р <0,05, ² р <0,01, ³ р <0,001 по сравнению с предыдущей возрастной группой для бронхов того же типа; * р <0,05, ^& р <0,01, ^# р <0,001 по сравнению с бронхами главного типа.

Реснитчатые эпителиоциты. Содержание мерцательных элементов у новорождённых минимально: 21% — в главных и сегментарных (мелких) бронхах, 26% — в долевых бронхах. На протяжении последующих двух недель количество реснитчатых эпителиоцитов в пласте увеличивается наиболее интенсивно: в 2,2 раза в ГБ, в 2,3 раза — в ДБ и в 2,7 раза — в СБ. К 30-м суткам после рождения плотность реснитчатых элементов возрастает по сравнению с новорождёнными в 2,5–2,7 раза в ГБ и ДБ, в 3,3 раза — в СБ (p <0,001). Эти значения сохраняются на стабильном уровне для каждого калибра бронхов на протяжении всего последующего периода наблюдения; при этом содержание реснитчатых клеток в долевых и сегментарных бронхах в среднем на 25–30% выше, чем в главных бронхах.

Изучение мерцательного аппарата реснитчатых клеток показало, что у новорождённых животных значения средней длины ресничек одинаковы во всех отделах бронхиального дерева (2,3–2,6 мкм, p >0,05); через 2 недели данный показатель возрастает в 1,2 раза в ГБ и ДБ, в 1,4 раза — в СБ. В возрастном интервале 6–20 месяцев средняя длина ресничек стабилизируется на уровне: ГБ — 3,8–3,9 мкм, ДБ — 2,8–3,1 мкм, СБ — 2,5–2,6 мкм. У старых животных в главных и сегментарных бронхах средняя длина ресничек ниже, чем у крыс в возрасте 20 месяцев — на 18% и 27% соответственно.

Частота биения ресничек в бронхах всех калибров максимальна у новорождённых (25–26 Гц), а к 14 суткам она снижается на 37–40%. Начиная с 3-х месяцев и на протяжении всего последующего периода наблюдения значения ЧБР стабилизируются в интервале 14,1–16,2 Гц. У крыс в возрасте 1 месяц ЧБР в долевых и сегментарных бронхах на 21–25% ниже, чем в главных. Во всех последующих временных точках статистически значимых различий в двигательной активности ресничек между бронхами разного калибра не выявлено.

При покадровом анализе видеофайлов установлено, что у новорождённых крыс быстрые биения коротких ресничек имеют слабо выраженный волнообразный характер и недостаточно синхронизированы (рис. 3, b–d). Появление типичных циклов движения ресничек с чёткими возвратной и эффективной фазами происходит к 14-м суткам постнатального развития. В возрастном периоде 14–26 месяцев волнообразный характер движения длинных ресничек в возвратной фазе наиболее выражен (рис. 3, f–h). Эти наблюдения подтверждаются результатами фазового анализа биения ресничек. У новорождённых животных длительность эффективной фазы удара минимальна (16,5–16,6 мс) во всех отделах бронхиального дерева, а к 14-м суткам и во все последующие сроки значения данного показателя устанавливаются на уровне 26–32 мс. При этом, независимо от частоты биения ресничек, базовая структура цикла сохраняется: отношение длительности фазы удара к общей продолжительности цикла (принятой за 1,0) остаётся стабильным во всех временных точках (0,38–0,41).

Рис. 3. Фазы биения ресничек эпителиоцитов главных бронхов крыс: а, e — схема; b–d, f–h — кадры прижизненной микровидеосъёмки; b–d — новорождённые крысы, f–h — крысы в возрасте 26 месяцев; а, b, f, g — возвратная фаза биения, стрелками указаны линии изгиба ресничек; c–e, h — эффективная фаза биения. Объектив ×40.

Fig. 3. Phases of ciliary beating in epithelial cells of the main bronchi in rats: a, e, diagram; b–d, f–h , frames from intravital microvideo recording; b–d, newborn rats; f–h, 26-month-old rats; a, b, f, g, recovery stroke phase, bending direction indicated by arrows; c–e, h, effective stroke phase. Objective lens, ×40.

Бокаловидные экзокриноциты. Первые единичные железистые элементы выявляются в эпителиальном пласте на 14-й день, а к возрасту 6 месяцев в главных и долевых бронхах их доля увеличивается в 10 раз (p <0,001), после чего стабилизируется на уровне 14–17%. Содержание бокаловидных клеток в сегментарных бронхах на протяжении всего периода наблюдения значимо ниже, чем в главных. Количество бокаловидных клеток в СБ с возрастом увеличивается не столь интенсивно и достигает максимума (11,2%) только в возрасте 26 месяцев.

Базальные и промежуточные клетки. Содержание базальных клеток в главных бронхах максимально (25%) у крыс в возрасте 14 суток. В интервале от 1 до 20 месяцев доля камбиальных элементов поддерживается на уровне 20–21% и только у старых крыс их количество снижается до 15,5%. В более мелких бронхах (ДБ, СБ) возрастная динамика доли базальных эпителиоцитов имеет сходный характер, однако их количество в подавляющем большинстве наблюдений статистически значимо ниже, чем в ГБ.

Промежуточные (немерцательные) клетки у новорождённых крыс во всех видах бронхов составляют 59–61% эпителиоцитов. К 14-м суткам их количество уменьшается в 2,1 раза в ГБ и в 2,5–2,7 раза — в ДБ и СБ, эта тенденция сохраняется в возрасте 1 и 3 месяца. К 6 месяцам содержание промежуточных клеток во всех отделах бронхиального дерева стабилизируется на уровне 9–11%. У стареющих и старых животных, на фоне высокого содержания дифференцированных элементов, количество промежуточных клеток достигает минимальных значений (3,4–4,6%).

Пролиферация клеток. Результаты оценки количества клеток, экспрессирующих Ki-67, в эпителии бронхов разного калибра представлены в табл. 3. Самое высокое содержание пролиферирующих клеток выявлено в первые 2 недели после рождения с максимумом на 14 сутки (8,2–8,7%). Начиная с 6 месяцев индекс Ki-67-положительных клеток в главных бронхах стабилизируется на уровне 2,5–3,9%. В долевых и сегментарных бронхах доля пролиферирующих эпителиоцитов существенно ниже и составляет в среднем 66% и 51% значений данного показателя в главных бронхах, соответственно. Во всех изученных временных точках экспрессия Ki-67 выявляется только в ядрах базальных и промежуточных (вставочных) эпителиоцитов.

ОБСУЖДЕНИЕ

Резюме основного результата исследования

Процессы морфогенеза респираторного эпителия бронхов наиболее активны в течение первого месяца жизни крыс и протекают асинхронно. В первые 2 недели после рождения наблюдается ускоренная дифференцировка реснитчатых клеток, а начиная с 14-го дня преобладает формирование субпопуляции бокаловидных клеток. Развитие цилиарного аппарата идёт опережающими темпами в сегментарных, а железистого — в главных бронхах.

Формирование типичной структуры респираторного эпителия завершается в период полового созревания (3 месяца), а в течение репродуктивного периода (6–14 месяцев) его количественные и структурные характеристики стабилизируются на уровне, характерном для данного калибра бронхов. При этом основные параметры цилиарной активности мерцательных клеток во всех отделах поддерживаются на одинаковом уровне. Сохранение высокой функциональной активности МЦТС бронхов при старении сопровождается морфологическими признаками повреждения клеток и снижением интенсивности клеточного обновления эпителиального пласта.

Обсуждение основного результата исследования

На всех уровнях ветвления бронхиального дерева у крыс структурная и функциональная дифференцировка респираторного эпителия идёт наиболее высокими темпами в течение первого месяца жизни. Наши наблюдения в целом согласуются с данными литературы, описывающими ранние стадии развития воздухоносных путей у лабораторных животных и человека [1, 5, 10]. Основными проявлениями морфогенеза, направленными на формирование МЦТС, являются активная пролиферация недифференцированных клеток и формирование субпопуляций реснитчатых и бокаловидных эпителиоцитов. Процессы дифференцировки этих клеточных линий у крыс протекают асинхронно: активный цилиогенез наиболее выражен в первые две недели после рождения, тогда как система секреторных элементов формируется к концу первого месяца постнатального периода. При этом развитие цилиарного аппарата идёт опережающими темпами в дистальных отделах бронхиального дерева (сегментарных бронхах), а железистого компонента — в главных бронхах. Активные процессы дифференцировки эпителиального пласта на протяжении 1-го месяца (период наиболее высоких темпов роста организма у крыс [8]) обеспечиваются высоким уровнем пролиферативной активности во всех отделах бронхиального дерева.

Частота биения ресничек у новорождённых крыс выше, чем во всех последующих возрастных периодах. Данный феномен, характерный для воздухоносных путей экспериментальных животных и человека [11, 12], в сочетании с недоразвитием реснитчатого аппарата и отсутствием на этом этапе дифференцированных секреторных элементов, свидетельствует о незрелости МЦТС к моменту рождения.

Завершение формирования структурно и функционально дифференцированного эпителиального пласта происходит в период полового созревания. У крыс в возрасте 3-х месяцев количественные характеристики субпопуляции реснитчатых клеток приближаются к таковым у половозрелых животных. Изучение двигательной активности цилиарного аппарата показало, что начиная с 3-х месяцев ЧБР стабилизируется и остаётся неизменной во всех последующих временных точках. При этом различий в мерцательной активности эпителиоцитов между бронхами разного калибра не выявлено. На протяжении всей жизни сохраняются стабильными и временные характеристики циклов биения ресничек. Эти наблюдения согласуются с результатами измерения скорости движения слизи в трахее крыс — формирование стабильного уровня мукоцилиарного клиренса (0,10–0,13 мм/сек) завершается к 3 месяцам после рождения [5]. Сходные по направленности результаты оценки ЧБР для отдельных возрастных периодов получены применительно к бронхиальному дереву грызунов и человека [13, 14].

У животных в репродуктивном периоде (6 и 14 месяцев) МЦТС бронхиального дерева достигает полной структурной и функциональной зрелости. Между бронхами разного калибра в дистальном направлении прослеживается градиент количества основных типов дифференцированных (реснитчатых, бокаловидных) и пролиферирующих клеток в эпителиальном пласте.

В бронхиальном дереве стареющих (20 месяцев) и старых (26 месяцев) животных сохраняется достигнутый ранее уровень структурной и функциональной дифференцировки эпителиального пласта: содержание реснитчатых и бокаловидных клеток достигает максимальных значений, двигательная активность цилиарного аппарата сохраняется. Сходные результаты ранее были получены в нашей лаборатории при изучении возрастных перестроек эпителия трахеи [5]. Наши результаты отличаются от наблюдений ряда авторов, обнаруживших при старении замедление мукоцилиарного транспорта в трахее мышей, морских свинок, а также в носовой полости человека [15, 16]. Помимо видовых особенностей, подобные расхождения могут быть обусловлены различиями в методах прижизненного изучения мерцательной активности. Кроме того, в исследованиях с участием людей нельзя исключить влияния сопутствующих патологических процессов в дыхательных путях.

Необходимо отметить, что вышеописанные процессы у стареющих и старых крыс происходят на фоне отчётливого снижения доли эпителиальных клеток, вступающих в митотический цикл. При замедлении темпов клеточного обновления ранее дифференцированные реснитчатые клетки вынуждены дольше сохранять свою жизнеспособность и функционировать в условиях повышенной нагрузки. Морфологически это выражается в увеличении количества гипертрофированных мерцательных клеток и появлении ультраструктурных признаков повреждения эпителиального пласта. Обнаруженные возрастные изменения дополняют данные литературы о характере инволютивных перестроек респираторного эпителия при старении: накопление ультраструктурных дефектов в микротрубочках ресничек [15]; нарушение синтеза белков, регулирующих проницаемость эпителиального пласта в зонах межклеточных контактов [3]; ослабление связи с базальной мембраной и усиление десквамации эпителиоцитов [17].

Ограничения исследования

Факторы, которые могли существенно повлиять на объект исследования, отсутствовали. Однако следует учитывать, что гистологическое строение бронхиального дерева крыс, человека и других млекопитающих имеет ряд существенных отличий.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Постнатальный морфогенез респираторного эпителия бронхов у крыс продолжается на протяжении всей жизни, при этом гистогенетические процессы наиболее активны в течение первого месяца после рождения. Характер и временная динамика структурной и функциональной дифференцировки двигательного (реснитчатые клетки) и секреторного (бокаловидные клетки) компонентов МЦТС имеют выраженные особенности в разных отделах трахеобронхиальной системы.

Одним из проявлений структурной и функциональной зрелости респираторного эпителия в репродуктивном возрасте является формирование в бронхах разного калибра градиента содержания основных типов дифференцированных и пролиферирующих эпителиоцитов — их доля уменьшается в дистальном направлении. Сохранение высокой функциональной активности МЦТС при старении происходит за счёт повышенной нагрузки на мерцательные и секреторные элементы, приводящей к усилению повреждения клеток и снижению компенсаторных возможностей эпителиального пласта.

В целом, респираторный эпителий всех отделов воздухоносных путей у крыс имеет сходные транспортные характеристики и функционирует как целостная тканевая система, обеспечивающая стабильный уровень мукоцилиарного клиренса на протяжении всей жизни животного.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. А.В. Павлов — концепция и дизайн исследования, анализ, интерпретация данных, написание и редактирование текста, подготовка иллюстраций, поиск литературных источников; Н.А. Тюмина — проведение исследования, сбор первичных данных и их статистическая обработка, подготовка иллюстраций, сбор и анализ литературных источников, написание текста. Все авторы одобрили рукопись (версию для публикации), а также согласились нести ответственность за все аспекты работы, гарантируя надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой её части.

Благодарности. Авторы выражают свою признательность доценту Ярославского государственного медицинского университета, канд. биол. наук Кемоклидзе К.Г. за помощь в получении первичных данных.

Этическая экспертиза. Обращение с животными осуществляли согласно действующим национальным и международным нормативам (ГОСТ 33215-2014 от 07.01.2016 г., ГОСТ 33216-2014, Директива 2010/63/ЕС ЕП и СЕС от 22.09.2010, Рекомендация Коллегии ЕЭК № 33 от 14.11.2023). Протокол исследования одобрен Этическим комитетом ФГБОУ ВО ЯГМУ Минздрава России (протокол № 07 от 16.02.2016).

Источники финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Раскрытие интересов. Авторы заявляют об отсутствии отношений, деятельности и интересов за последние три года, связанных с третьими лицами (коммерческими и некоммерческими), интересы которых могут быть затронуты содержанием статьи.

Доступ к данным. Все данные, полученные в настоящем исследовании, представлены в статье.

Генеративный искусственный интеллект. При создании настоящей статьи технологии генеративного искусственного интеллекта не использовали.

Рассмотрение и рецензирование. Настоящая работа подана в журнал в инициативном порядке и рассмотрена по обычной процедуре. В рецензировании участвовали два внешних рецензента, член редакционной коллегии и научный редактор издания.

ADDITIONAL INFORMATION

Author contributions: A.V. Pavlov: conceptualization, methodology, formal analysis, writing—original draft, writing—review & editing, visualization, search for sources; N.A. Tyumina: investigation, data curation, formal analysis, visualization, collection and analysis of sources, writing—original draft. All the authors approved the version of the manuscript to be published and agreed to be accountable for all aspects of the work, ensuring that questions related to the accuracy or integrity of any part of the work are appropriately investigated and resolved.

Acknowledgements: The authors express their gratitude to K.G. Kemoklidze, Cand. Sci. (Biology), Associate Professor at Yaroslavl State Medical University, for assistance in obtaining the raw data.

Ethics approval: Animal handling was carried out in accordance with current national and international regulations (GOST 33215-2014 dated January 7, 2016; GOST 33216-2014; Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council dated September 22, 2010; Recommendation of the EEC Board No. 33 dated November 14, 2023). The study protocol was approved by the Ethics Committee of Yaroslavl State Medical University (Protocol No. 07 dated February 16, 2016).

Funding sources: The authors declare no external funding was received for conducting the study.

Disclosure of interests: The authors have no relationships, activities, or interests for the last three years related to for-profit or not-for-profit third parties whose interests may be affected by the content of the article.

Data availability: All data obtained in the present study are presented in the article.

Generative artificial intelligence: No generative artificial intelligence technologies were used in the creation of this article.

Review and peer review: This work was submitted to the journal on an unsolicited basis and reviewed through the standard procedure. The review process involved two external peer reviewers, a member of the editorial board, and the journal's scientific editor.

¹ Кемоклидзе К.Г. Универсальный гистологический счётчик. Версия 2.0. Свидетельство о государственной регистрации программ для ЭВМ № 2012617618 Российская Федерация. Заявка № 2012615714; дата заявки 09.07.2012; дата регистрации 23.08.2012.

Kemoklidze KG. Universal histological counter. Version 2.0. Certificate of state registration of computer programs No. 2012617618 Russian Federation. Application No. 2012615714; application date 09.07.2012; registration date 23.08.2012.

Об авторах

Алексей Владимирович Павлов

Автор, ответственный за переписку.
Email: pavlov@ysmu.ru
ORCID iD: 0000-0001-8227-9997
SPIN-код: 8854-7083

д-р мед. наук

Наталья Андреевна Тюмина

Email: Natellamail@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7001-0851
SPIN-код: 8839-8300
Россия, Ярославль

Список литературы

Дополнительные файлы

Доп. файлы

Действие

1. JATS XML

Скачать

2. Рис. 1. Эпителиальная выстилка бронхов крыс: а — главного бронха, b — долевого бронха, c–e — сегментарных бронхов у новорождённых; f — сегментарного бронха у крыс в возрасте 8 суток. 1 — реснитчатые, 2 — щёточные (безреснитчатые), 3 — базальные клетки. Трансмиссионная электронная микроскопия, а–c — увеличение ×5000, d, e — ×8000; f — сканирующая электронная микроскопия, увеличение ×4500.

Скачать (1MB)

Метаданные

3. Рис. 2. Эпителиальная выстилка бронхов у крыс: в возрасте 6 месяцев а — главного бронха, b — сегментарного бронха; в возрасте 26 месяцев c — сегментарного бронха, d–f — главных бронхов. 1 — реснитчатые, 2 — бокаловидные, 3 — щёточные (безреснитчатые), 4 — базальные клетки, 5 — гипертрофированная реснитчатая клетка, 6 — участки межклеточного отёка, 7 — эпителиоцит с морфологическими признаками повреждения. Трансмиссионная электронная микроскопия, а, b, e, f — увеличение ×5000, c, d — ×10000.

Скачать (1MB)

Метаданные

4. Рис. 3. Фазы биения ресничек эпителиоцитов главных бронхов крыс: а, e — схема; b–d, f–h — кадры прижизненной микровидеосъёмки; b–d — новорождённые крысы, f–h — крысы в возрасте 26 месяцев; а, b, f, g — возвратная фаза биения, стрелками указаны линии изгиба ресничек; c–e, h — эффективная фаза биения. Объектив ×40.

Скачать (285KB)

Метаданные