ВЗАИМОСВЯЗЬ ДООПЕРАЦИОННЫХ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ И КАЧЕСТВА ПРИЖИВЛЕНИЯ ВАСКУЛЯРИЗОВАННЫХ КОЖНО-ФАСЦИАЛЬНЫХ ЛОСКУТОВ У КРЫС

Полный текст

В лечении дефектов покровных тканей при повреждениях мирного и военного времени, а также последствиях онкологических резекций существенная роль принадлежит пластике васкуляризованными полнослойными кожнофасциальными лоскутами с осевым кровоснабжением. Развитие микрохирургической техники обеспечивает их успешное приживление в 93-98% случаев [8]. Характерными осложнениями являются частичные некрозы, поверхностный эпидермолизис, венозная недостаточность [10], которые наносят психологическую травму пациентам и увеличивают затраты на лечение. Основная причина таких состояний - реперфузионное повреждение предварительно ишемизированных тканей, которое включает оксидативный стресс, нарушение эндотелиального барьера, накопление медиаторов воспаления и протеолитических ферментов, что в итоге приводит к некротической гибели клеток. В реализации молекулярных механизмов процесса изучена роль циркулирующих лейкоцитов, тромбоцитов и T-лимфоцитов [15]. Сведений о влиянии их количества в периферической крови в дооперационный период на выраженность синдрома ишемии-реперфузии после реваскуляризации в литературе не найдено, хотя известно, что снижение гематокрита повышает вероятность приживления ишемизированных кожно-фасциальных лоскутов [7]. Цель данного исследования - выявление взаимосвязи дооперационных морфологических показателей периферической крови и качества приживления васкуляризованных лоскутов на стандартизованной биологической модели. Материал и методы. Исследование выполнено согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.1977 г.) и Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации о гуманном обращении с животными. Работа включала 2 этапа. На 1-м этапе для получения референтных значений показателей периферической крови у интактных половорелых крыс-самцов (n=30) линии Вистар (масса 460-560 г, возраст 1 год) брали кровь из хвостовой вены в условиях операционной под общей анестезией, которая достигалась внутримышечным введением гидрохлорида ксилазина (0,8 мг/100 г) и тилетамина/золазепама (0,4 мг/100 г). Необходимость этого этапа обусловлена вариабельностью лейкоцитарной формулы крови в зависимости не только от линии и возраста животных, но и от условий содержания [5] и пищевого рациона [6]. На 2-м этапе у 10 крыс сразу после взятия крови была проведена операция формирования и репозиции васкуляризованного кожно-фасциально-жирового лоскута на основе поверхностной нижней эпигастральной артерии (ПНЭА). Для его выкраивания использовали анатомические ориентиры: верхняя граница - вдоль нижнего края рёберной дуги, нижняя - равная ей параллельная линия на уровне гребня подвздошной кости, медиальная - параллельно средней линии живота, отступив от неё 0,5 см, латеральная - параллельно медиальной. Размеры лоскута составляли 6×3 см. Разрез кожи проводили до апоневроза, лоскут включал кожу, подкожную основу и поверхностную фасцию, а в паховой области - предбрюшинную жировую ткань и поверхностный нижний эпигастральный сосудистый пучок. Все перфораторы и латеральные ветви ПНЭА пересекали и коагулировали, что давало возможность поднять лоскут. После выделения места отхождения ПНЭА от бедренной артерии на артерию накладывали клипсу, что прекращало кровоток в лоскуте. Через 90 мин клипсу снимали, осуществляя восстановление кровотока, а лоскут реплантировали in situ, подшивая его нитями 5/0. Через 12 сут после операции животных выводили из опыта путем передозировки тиопентал-натрия. Для анализа состояния лоскута получали его полноцветные цифровые изображения с помощью камеры Sony Cyber-shot DSC-HX100V (Sony, Япония) в режиме макросъемки, переносили в память компьютера и сохраняли с расширением -.jpg без сжатия. Наружную поверхность лоскута фотографировали дважды - после операции и эвтаназии, а внутреннюю - после эвтаназии. Рядом с объектом съемки помещали эталон длины для линейной калибровки изображения по общепринятым принципам. Используя электронную версию оригинальной тестовой решетки [4], в графическом редакторе PhotoFiltre методом планиметрии с точечным счетом в изображении наружной поверхности лоскута определяли долю дефектов эпидермиса на площади лоскута. Аналогичным методом на изображении внутренней поверхности лоскута высчитывали доли сосудистых структур и экстравазаций. Применяли общепринятые унифицированные методики анализа жидкой периферической крови и микроскопии сухих фиксированных и окрашенных по Романовскому-Гимзе мазков с дифференцированием лейкоцитов. Кроме того, с помощью аппаратно-программного комплекса (световой исследовательский микроскоп МИКМЕД-5 - ЛОМО, Россия, соединённый с цифровой камерой Webbers с объективом MYscope 500 M и персональным компьютером) получали цифровые изображения 100 полей зрения (инструментальное увеличение 2025), содержащих лимфоциты. Подсчитывали их количество и представительство типичных и атипичных лимфоцитов, а также реактивных светлых больших лимфоцитов, идентифицируемых по принятым гематологическим критериям [1, 12]. Статистическую обработку количественных данных проводили с использованием критериев Манна- Уитни и Барнарда, значения которых получали, используя программу Attestat [2]. Результаты исследования. В ближайшие полчаса после операции цианоз краниальной части лоскута наблюдался у двух животных, в период от 3 до 5 сут - у четырёх. Начиная с 6-7-х суток, у всех животных происходила эпителизация линии швов, в некоторых её участках формировались экскориации. К 7-м суткам в эпигастральной части лоскута у 3 животных из 10 появлялись участки эпидермолизиса. На основании характера и суммарной величины дефектов эпидермиса животные были подразделены на 2 группы. В 1-й группе (n=7) были обнаружены только экскориации, составившие от 0,3 до 6% площади лоскута, во 2-й группе (n=3) - экскориации и эпидермолизис, занимавшие суммарно от 8 до 60% площади лоскута. Эта группа характеризовалась также и более выраженными экстравазациями (P<0,05), но незначимо лучшей васкуляризацией лоскута (P>0,05) (табл. 1). Ретроспективный анализ морфологических показателей периферической крови, взятой до операции, показал, что параметры у животных обеих групп находились в диапазоне референтных значений (табл. 2, 3), однако средние показатели содержания лейкоцитов и тромбоцитов были больше во 2-й группе на 21,4 и 11,5% соответственно (P=0,05). Сочетание высоких значений содержания лейкоцитов и тромбоцитов не встретилось ни у одного из 7 животных 1-й группы, но наблюдалось у всех животных 2-й группы. Проверка гипотезы о различии частоты сцепления этих признаков по критерию Барнарда даёт P=0. Во 2-й группе отсутствовали базофилы, а среднее содержание нейтрофилов и эозинофилов (см. табл. 3) было больше, чем в 1-й группе на 79,4 (P=0,05) и 204,5% (P<0,05) соответственно, различия в содержании моноцитов и лимфоцитов были незначимы. При анализе агранулоцитов (рисунок) установлено, что доля светлых реактивных лимфоцитов в 1-й группе варьировала от 5,8 до 23,8%, а во 2-й группе - от 23,9 до 41% (P<0,05). Большинство этих клеток имели отростчато-лопастную форму и охватывали эритроциты (см. рисунок, д-ж). Во 2-й группе чаще встречались аналогично взаимодействующие с эритроцитами реактивные моноциты (см. рисунок, з). Среди атипичных лимфоцитов (см. рисунок, и) 1-й группы преобладали многоядерные, а для 2-й группы животных были более характерны дегенеративно-измененные вытянутые формы. Через 12 сут после операции у всех крыс встречались многоядерные реактивные лимфоциты. В 1-й группе гематологические показатели приближались к норме, а во 2-й группе отмечены умеренные нейтрофилия и лимфопения, содержание реактивных лимфоцитов было значимо больше, чем в 1-й группе (P<0,05). Обсуждение полученных данных. Различные варианты пересадки или репозиции in situ лоскутов с осевым кровоснабжением на основе ПНЭА крыс широко применяются в исследованиях патогенеза синдрома ишемии-реперфузии и разработке методов его профилактики и лечения. Наиболее близкий аналог использованной нами экспериментальной модели [13] предусматривает 8-часовую ишемию. Мы учли, что при плановых пересадках и транспозициях васкуляризованных лоскутов в клинике период выключения кровотока обычно не превышает 90 мин [14]. Возраст животных выбран на основании данных о периодизации жизни крыс относительно возрастных периодов человека [16] с учётом того, что в большинстве клинических исследований средний возраст пациентов с дефектами покровных тканей превышает 30 лет. Как показали результаты, в обозначенных условиях у половозрелых крыс линии Вистар в 7 случаях из 10 достигнуто полное приживление лоскута, ау 3 в области его проксимальной половины наблюдался эпидермолизис. Для оценки состояния кожно-фасциального лоскута применяли компьютерный анализ его цифровых изображений, который в последние годы используется в качестве основного, ав некоторых публикациях - единственного метода оценки [11], что свидетельствует об оптимальном соотношении его затратности и информативности. Применение в нашем исследовании режима макросъёмки как наружной, так и внутренней поверхности лоскута позволило объективизировать оценку приживления и васкуляризации лоскута, в том числе выраженность его реперфузионного повреждения. Нами впервые получены данные о взаимосвязи качества приживления васкуляризованного лоскута с дооперационными показателями содержания лейкоцитов, тромбоцитов, нейтрофилов, эозинофилов и реактивных лимфоцитов в периферической крови. Они согласуются с известными представлениями о роли этих клеток в патогенезе синдрома ишемии-реперфузии. В частности, сочетание высоких показателей содержания тромбоцитов и лейкоцитов, характерное для животных с худшими параметрами приживления, согласуется с данными о том, что аккумуляция тромбоцитов в постишемических венулах зависит от адгезии лейкоцитов (главным образом нейтрофилов) к эндотелию, и наоборот, адгезия лейкоцитов к эндотелию после ишемии- реперфузии требует присутствия тромбоцитарного P-селектина [15]. Наряду с нейтрофилами, во вторичных постишемических повреждениях тканей существенную роль играют эозинофилы. Об этом свидетельствует их быстрое накопление в предварительно ишемизированных тканях у экспериментальных животных [9] и человека [3]. Вопрос о роли реактивных агранулоцитов требует дополнительных исследований. Известна роль T-лимфоцитов в нарушении эндотелиального барьера [15]. Нами установлено, что для животных с отчетливо выраженными признаками реперфузионных повреждений лоскута было характерно высокое содержание реактивных светлых лимфоцитов и моноцитов, охватывающих эритроциты. Весьма вероятно, что такие взаимодействия циркулирующих клеток затрудняют капиллярный кровоток и сказываются неблагоприятно на репарации ишемизированных тканей. Сочетание высоких, хотя и не выходящих за пределы физиологической нормы, значений числа лейкоцитов, тромбоцитов, нейтрофилов и эозинофилов с повышенным содержанием реактивных больших светлых лимфоцитов в периферической крови до операции повышает вероятность дефектов приживления васкуляризованных кожно-фасциально-жировых лоскутов у крыс. Полученные результаты дают основание исследования дооперационных показателей периферической крови для решения вопросов прогностической значимости у человека при плановых операциях по пересадке и транспозиции лоскутов.

Об авторах

Наталья Анатольевна Щудло

Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия» им. акад. Г. А. Илизарова

Email: nshchudlo@mail.ru
клинико-экспериментальная лаборатория реконструктивно-восстановительной микрохирургии и хирургии кисти 640014, г. Курган, ул. М. Ульяновой, 6

Михаил Моисеевич Щудло

Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия» им. акад. Г. А. Илизарова

Email: m.m.sch@mail.ru
клинико-экспериментальная лаборатория реконструктивно-восстановительной микрохирургии и хирургии кисти 640014, г. Курган, ул. М. Ульяновой, 6

Людмила Ивановна Сбродова

Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия» им. акад. Г. А. Илизарова

клинико-экспериментальная лаборатория реконструктивно-восстановительной микрохирургии и хирургии кисти 640014, г. Курган, ул. М. Ульяновой, 6

Список литературы

Дополнительные файлы