INTERRELATION BETWEEN THE PREOPERATIVE MORPHOLOGICAL CHARACTERISTICS OF PERIPHERAL BLOOD AND THE QUALITY OF ENGRAFTMENT OF VASCULARIZED ADIPO-FASCIO-CUTANEOUS FLAPS IN RATS

Full Text

В лечении дефектов покровных тканей при повреждениях мирного и военного времени, а также последствиях онкологических резекций существенная роль принадлежит пластике васкуляризованными полнослойными кожнофасциальными лоскутами с осевым кровоснабжением. Развитие микрохирургической техники обеспечивает их успешное приживление в 93-98% случаев [8]. Характерными осложнениями являются частичные некрозы, поверхностный эпидермолизис, венозная недостаточность [10], которые наносят психологическую травму пациентам и увеличивают затраты на лечение. Основная причина таких состояний - реперфузионное повреждение предварительно ишемизированных тканей, которое включает оксидативный стресс, нарушение эндотелиального барьера, накопление медиаторов воспаления и протеолитических ферментов, что в итоге приводит к некротической гибели клеток. В реализации молекулярных механизмов процесса изучена роль циркулирующих лейкоцитов, тромбоцитов и T-лимфоцитов [15]. Сведений о влиянии их количества в периферической крови в дооперационный период на выраженность синдрома ишемии-реперфузии после реваскуляризации в литературе не найдено, хотя известно, что снижение гематокрита повышает вероятность приживления ишемизированных кожно-фасциальных лоскутов [7]. Цель данного исследования - выявление взаимосвязи дооперационных морфологических показателей периферической крови и качества приживления васкуляризованных лоскутов на стандартизованной биологической модели. Материал и методы. Исследование выполнено согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.1977 г.) и Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации о гуманном обращении с животными. Работа включала 2 этапа. На 1-м этапе для получения референтных значений показателей периферической крови у интактных половорелых крыс-самцов (n=30) линии Вистар (масса 460-560 г, возраст 1 год) брали кровь из хвостовой вены в условиях операционной под общей анестезией, которая достигалась внутримышечным введением гидрохлорида ксилазина (0,8 мг/100 г) и тилетамина/золазепама (0,4 мг/100 г). Необходимость этого этапа обусловлена вариабельностью лейкоцитарной формулы крови в зависимости не только от линии и возраста животных, но и от условий содержания [5] и пищевого рациона [6]. На 2-м этапе у 10 крыс сразу после взятия крови была проведена операция формирования и репозиции васкуляризованного кожно-фасциально-жирового лоскута на основе поверхностной нижней эпигастральной артерии (ПНЭА). Для его выкраивания использовали анатомические ориентиры: верхняя граница - вдоль нижнего края рёберной дуги, нижняя - равная ей параллельная линия на уровне гребня подвздошной кости, медиальная - параллельно средней линии живота, отступив от неё 0,5 см, латеральная - параллельно медиальной. Размеры лоскута составляли 6×3 см. Разрез кожи проводили до апоневроза, лоскут включал кожу, подкожную основу и поверхностную фасцию, а в паховой области - предбрюшинную жировую ткань и поверхностный нижний эпигастральный сосудистый пучок. Все перфораторы и латеральные ветви ПНЭА пересекали и коагулировали, что давало возможность поднять лоскут. После выделения места отхождения ПНЭА от бедренной артерии на артерию накладывали клипсу, что прекращало кровоток в лоскуте. Через 90 мин клипсу снимали, осуществляя восстановление кровотока, а лоскут реплантировали in situ, подшивая его нитями 5/0. Через 12 сут после операции животных выводили из опыта путем передозировки тиопентал-натрия. Для анализа состояния лоскута получали его полноцветные цифровые изображения с помощью камеры Sony Cyber-shot DSC-HX100V (Sony, Япония) в режиме макросъемки, переносили в память компьютера и сохраняли с расширением -.jpg без сжатия. Наружную поверхность лоскута фотографировали дважды - после операции и эвтаназии, а внутреннюю - после эвтаназии. Рядом с объектом съемки помещали эталон длины для линейной калибровки изображения по общепринятым принципам. Используя электронную версию оригинальной тестовой решетки [4], в графическом редакторе PhotoFiltre методом планиметрии с точечным счетом в изображении наружной поверхности лоскута определяли долю дефектов эпидермиса на площади лоскута. Аналогичным методом на изображении внутренней поверхности лоскута высчитывали доли сосудистых структур и экстравазаций. Применяли общепринятые унифицированные методики анализа жидкой периферической крови и микроскопии сухих фиксированных и окрашенных по Романовскому-Гимзе мазков с дифференцированием лейкоцитов. Кроме того, с помощью аппаратно-программного комплекса (световой исследовательский микроскоп МИКМЕД-5 - ЛОМО, Россия, соединённый с цифровой камерой Webbers с объективом MYscope 500 M и персональным компьютером) получали цифровые изображения 100 полей зрения (инструментальное увеличение 2025), содержащих лимфоциты. Подсчитывали их количество и представительство типичных и атипичных лимфоцитов, а также реактивных светлых больших лимфоцитов, идентифицируемых по принятым гематологическим критериям [1, 12]. Статистическую обработку количественных данных проводили с использованием критериев Манна- Уитни и Барнарда, значения которых получали, используя программу Attestat [2]. Результаты исследования. В ближайшие полчаса после операции цианоз краниальной части лоскута наблюдался у двух животных, в период от 3 до 5 сут - у четырёх. Начиная с 6-7-х суток, у всех животных происходила эпителизация линии швов, в некоторых её участках формировались экскориации. К 7-м суткам в эпигастральной части лоскута у 3 животных из 10 появлялись участки эпидермолизиса. На основании характера и суммарной величины дефектов эпидермиса животные были подразделены на 2 группы. В 1-й группе (n=7) были обнаружены только экскориации, составившие от 0,3 до 6% площади лоскута, во 2-й группе (n=3) - экскориации и эпидермолизис, занимавшие суммарно от 8 до 60% площади лоскута. Эта группа характеризовалась также и более выраженными экстравазациями (P<0,05), но незначимо лучшей васкуляризацией лоскута (P>0,05) (табл. 1). Ретроспективный анализ морфологических показателей периферической крови, взятой до операции, показал, что параметры у животных обеих групп находились в диапазоне референтных значений (табл. 2, 3), однако средние показатели содержания лейкоцитов и тромбоцитов были больше во 2-й группе на 21,4 и 11,5% соответственно (P=0,05). Сочетание высоких значений содержания лейкоцитов и тромбоцитов не встретилось ни у одного из 7 животных 1-й группы, но наблюдалось у всех животных 2-й группы. Проверка гипотезы о различии частоты сцепления этих признаков по критерию Барнарда даёт P=0. Во 2-й группе отсутствовали базофилы, а среднее содержание нейтрофилов и эозинофилов (см. табл. 3) было больше, чем в 1-й группе на 79,4 (P=0,05) и 204,5% (P<0,05) соответственно, различия в содержании моноцитов и лимфоцитов были незначимы. При анализе агранулоцитов (рисунок) установлено, что доля светлых реактивных лимфоцитов в 1-й группе варьировала от 5,8 до 23,8%, а во 2-й группе - от 23,9 до 41% (P<0,05). Большинство этих клеток имели отростчато-лопастную форму и охватывали эритроциты (см. рисунок, д-ж). Во 2-й группе чаще встречались аналогично взаимодействующие с эритроцитами реактивные моноциты (см. рисунок, з). Среди атипичных лимфоцитов (см. рисунок, и) 1-й группы преобладали многоядерные, а для 2-й группы животных были более характерны дегенеративно-измененные вытянутые формы. Через 12 сут после операции у всех крыс встречались многоядерные реактивные лимфоциты. В 1-й группе гематологические показатели приближались к норме, а во 2-й группе отмечены умеренные нейтрофилия и лимфопения, содержание реактивных лимфоцитов было значимо больше, чем в 1-й группе (P<0,05). Обсуждение полученных данных. Различные варианты пересадки или репозиции in situ лоскутов с осевым кровоснабжением на основе ПНЭА крыс широко применяются в исследованиях патогенеза синдрома ишемии-реперфузии и разработке методов его профилактики и лечения. Наиболее близкий аналог использованной нами экспериментальной модели [13] предусматривает 8-часовую ишемию. Мы учли, что при плановых пересадках и транспозициях васкуляризованных лоскутов в клинике период выключения кровотока обычно не превышает 90 мин [14]. Возраст животных выбран на основании данных о периодизации жизни крыс относительно возрастных периодов человека [16] с учётом того, что в большинстве клинических исследований средний возраст пациентов с дефектами покровных тканей превышает 30 лет. Как показали результаты, в обозначенных условиях у половозрелых крыс линии Вистар в 7 случаях из 10 достигнуто полное приживление лоскута, ау 3 в области его проксимальной половины наблюдался эпидермолизис. Для оценки состояния кожно-фасциального лоскута применяли компьютерный анализ его цифровых изображений, который в последние годы используется в качестве основного, ав некоторых публикациях - единственного метода оценки [11], что свидетельствует об оптимальном соотношении его затратности и информативности. Применение в нашем исследовании режима макросъёмки как наружной, так и внутренней поверхности лоскута позволило объективизировать оценку приживления и васкуляризации лоскута, в том числе выраженность его реперфузионного повреждения. Нами впервые получены данные о взаимосвязи качества приживления васкуляризованного лоскута с дооперационными показателями содержания лейкоцитов, тромбоцитов, нейтрофилов, эозинофилов и реактивных лимфоцитов в периферической крови. Они согласуются с известными представлениями о роли этих клеток в патогенезе синдрома ишемии-реперфузии. В частности, сочетание высоких показателей содержания тромбоцитов и лейкоцитов, характерное для животных с худшими параметрами приживления, согласуется с данными о том, что аккумуляция тромбоцитов в постишемических венулах зависит от адгезии лейкоцитов (главным образом нейтрофилов) к эндотелию, и наоборот, адгезия лейкоцитов к эндотелию после ишемии- реперфузии требует присутствия тромбоцитарного P-селектина [15]. Наряду с нейтрофилами, во вторичных постишемических повреждениях тканей существенную роль играют эозинофилы. Об этом свидетельствует их быстрое накопление в предварительно ишемизированных тканях у экспериментальных животных [9] и человека [3]. Вопрос о роли реактивных агранулоцитов требует дополнительных исследований. Известна роль T-лимфоцитов в нарушении эндотелиального барьера [15]. Нами установлено, что для животных с отчетливо выраженными признаками реперфузионных повреждений лоскута было характерно высокое содержание реактивных светлых лимфоцитов и моноцитов, охватывающих эритроциты. Весьма вероятно, что такие взаимодействия циркулирующих клеток затрудняют капиллярный кровоток и сказываются неблагоприятно на репарации ишемизированных тканей. Сочетание высоких, хотя и не выходящих за пределы физиологической нормы, значений числа лейкоцитов, тромбоцитов, нейтрофилов и эозинофилов с повышенным содержанием реактивных больших светлых лимфоцитов в периферической крови до операции повышает вероятность дефектов приживления васкуляризованных кожно-фасциально-жировых лоскутов у крыс. Полученные результаты дают основание исследования дооперационных показателей периферической крови для решения вопросов прогностической значимости у человека при плановых операциях по пересадке и транспозиции лоскутов.

About the authors

N. A Shchudlo

G. A. Ilizarov Russian Scientific Center «Restorative Traumatology and Orthopaedics»

Email: nshchudlo@mail.ru
Clinical and Experimental Laboratory of Reconstructive Microsurgery and Hand Surgery

M. M. Shchudlo

G. A. Ilizarov Russian Scientific Center «Restorative Traumatology and Orthopaedics»

Email: m.m.sch@mail.ru
Clinical and Experimental Laboratory of Reconstructive Microsurgery and Hand Surgery

L. I. Sbrodova

G. A. Ilizarov Russian Scientific Center «Restorative Traumatology and Orthopaedics»

Clinical and Experimental Laboratory of Reconstructive Microsurgery and Hand Surgery

References

Supplementary files