PERIFOCAL TISSUE REACTIONS TO IMPLANTATION OF THE SAMPLES OF HYDROGEL MATERIAL BASED ON POLYACRYLAMIDE WITH THE ADDITION OF THE CELLULOSE (AN EXPERIMENTAL STUDY)

全文:

Замещение дефектов суставного хряща является нерешенной и весьма актуальной проблемой современной медицины, поскольку гиалиновый хрящ не способен регенерировать в организме [5] и при различных видах двигательной активности подвергается очень высоким и продолжительным нагрузкам сжатия: от 3 до 20 МПа, а величина его деформации достигает при этом 30-50% [10, 11]. Такие методы восстановления хряща, как заполнение дефектов тканеинженерными конструкциями или скаффолдами, которые заселяются аутологичными мультипотентными стромальными стволовыми клетками костномозгового происхождения, до настоящего времени не позволяют вырастить хрящ, эквивалентный по механическим характеристикам гиалиновому [9, 13]. Заполнение остеохондральных дефектов бесклеточным полимерным каркасом для индуцирования процессов регенерации с участием собственных клеток хряща также дало неудовлетворительные результаты [8]. Механические характеристики известных в настоящее время гидрогелей, которые позиционируются как искусственные хрящи, например, материал «Salubria», другое название «Cartiva» (Salumedica, США), который уже применяется в качестве искусственного заменителя хрящевых тканей, а также разработанные в Японии гидрогели со структурой взаимопроникающих полимерных сеток, недостаточно положительны [12, 14]. Так, при наиболее высоких значениях деформации сжатия, наблюдаемой при функционировании хрящей в суставах (30-50%), фиксируемое напряжение не превышает 1-2 МПа, что на порядок ниже соответствующих значений напряжения, испытываемых гиалиновым хрящом [2]. Таким образом, можно констатировать, что до сих пор проблема замещения глубоких дефектов хрящевой ткани в суставах фактически не решена. С учетом сказанного разработка и внедрение в клиническую практику новых видов биосовместимых материалов, которые соответствуют приведенным выше требованиям к функциональным нагрузкам, является чрезвычайно актуальной задачей. Разработанные нами гидрогелевые материалы на основе полиакриламида (ПААм), упрочненные за счет добавления растительной (РЦ) либо бактериальной целлюлозы (БЦ), продемонстрировали способность выдерживать нагрузки, аналогичные тем, которым подвергается гиалиновый хрящ в режиме длительных циклических испытаний без признаков разрушения [2, 6]. Цель настоящего исследования - изучение перифокальных тканевых реакций на имплантацию образцов двух видов полиакриламидного гидрогеля с добавлением РЦ и БЦ в мягкие ткани, полость сустава, а также в дефект суставного хряща и субхондральной кости в экспериментах in vivo. Материал и методы. Образцы композиционных гидрогелей, содержащие РЦ или БЦ, синтезировали методом радикальной полимеризации акриламида, которую проводили внутри набухшей в реакционном растворе целлюлозы. При этом конечная концентрация акриламида в гидрогелях, которые далее использовались в экспериментах in vivo, была менее 0,1 ppm (менее 0,1 г на 1 тонну сухого полимера) [2, 6]. Исследование выполнено на 48 11-12-месячных самках белых лабораторных беспородных крыс массой 220±20 г и 24 6-9-месячных самках кроликов породы шиншилла массой 3,0±0,26 кг. Содержание и использование лабораторных животных соответствовало правилам, принятым Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных целей, а также приказу МЗ РФ № 708Н от 23 августа 2010 г. Все манипуляции проводили в условиях чистой операционной вивария Российского научно-исследовательского института травматологии и ортопедии им. Р. Р. Вредена с соблюдением правил асептики и антисептики под внутривенным наркозом (кетамин, диазепам). Профилактику инфекционных осложнений осуществляли цефтриаксоном. Первой группе подопытных животных (24 крысы) имплантировали экспериментальные образцы гидрогеля (диаметр - приблизительно 3,5 мм, толщина - 2 мм), содержащие РЦ или БЦ, в широчайшую мышцу спины. Второй группе животных (24 крысы) имплантировали такие же образцы гидрогеля в верхний заворот коленного сустава. Животным 3-й группы (24 кролика) после разреза и вскрытия коленного сустава в межмыщелковой области бедренной кости формировали дефект хряща и субхондральной кости, в который помещали исследуемый образец (диаметр - приблизительно 2,5 мм, высота - 3,5 мм), содержащий РЦ или БЦ. Животных выводили из опыта путем передозировки тиопентал-натрия на 5-, 14-, 45-еи 90-е сутки (по 3 животных на каждую временную точку в каждой группе и при каждом виде гидрогеля), после чего выделяли макропрепарат, содержащий имплантат с окружающими его тканями. Материал фиксировали 10% нейтральным формалином в течение 24 ч, при наличии в нем кости проводили декальцинацию в насыщенном растворе трилона В и повторно фиксировали в 10% нейтральном формалине, обезвоживали в этаноле восходящей концентрации с использованием установки проводки гистологического материала Microm SТР- 120 (Micron Technology, США) и заливали в парафин, применяя заливочную установку Leica (Leica, Германия). Срезы толщиной 5 мкм получали с помощью санного микротома Leica (Leica Microsystems, Германия) и окрашивали гематоксилином - эозином (Биовитрум, Россия) с использованием установки окраски «Рафаэлло» (DIAPATH, S.p.A., Италия). Патоморфологический анализ гистологических препаратов и фотодокументирование проводили, используя микроскоп Nikon E-50i (Nikon, Япония), объективы: 4, 10, 20 и 40 и окуляр 10 (Nikon, Япония). Измерение толщины капсулы вокруг имплантата проводили с помощью системы анализа изображения ВидеоТест-Морфоверсия 4,0 (ВидеоТест, Россия). Результаты исследования. В течение всего срока исследования у экспериментальных животных не было выявлено внешних признаков воспаления в области установки имплантатов. Все раны зажили первичным натяжением. Со 2-х суток наблюдения животные не щадили оперированные конечности, используя их для передвижения в клетках. При выделении макропрепаратов признаков миграции и дезинтеграции имплантатов не наблюдалось. На 5-е сутки после имплантации в мышцу спины у всех экспериментальных животных отмечена умеренная воспалительная реакция как ответ на операционную травму. Перифокально вокруг гидрогеля, содержащего РЦ, была сформирована зрелая, а вокруг образца, содержащего БЦ, - молодая грануляционная ткань. Независимо от природы имплантата, отмечалась перифокальная умеренно выраженная инфильтрация макрофагами. На 14-е сутки после имплантации в мышечной ткани вокруг образца, содержащего РЦ, сформировалась фиброзная капсула. Инфильтрация плазматическими клетками, лимфоцитами и макрофагами была слабо выражена и имела преимущественно очаговый характер. Вокруг образца искусственного хряща, содержащего БЦ, в указанные сроки определялась воспалительная реакция несколько более выраженная, чем вокруг образца, содержащего РЦ. В более поздние сроки исследования, вне зависимости от природы имплантата, признаки перифокального воспаления не определялись. К 45-м суткам имплантаты, содержащие РЦ, окружала фиброзная капсула толщиной 100- 200 мкм (рис. 1, а), в то время как у животных с имплантированным гидрогелем, содержащим БЦ, она была тоньше (см. рис. 1, б). К концу срока исследования картина несколько изменилась: вокруг имплантата, содержащего РЦ, определялась тонкая фиброзная капсула с очагами утолщения (от 35 до 420 мкм), в которых были выявлены скопления макрофагов с отложениями частиц имплантата (см. рис. 1, в). Капсула, окружающая имплантат, содержащий БЦ, была более равномерная по толщине (от 120 до 350 мкм) со слабо выраженной диффузной равномерной инфильтрацией моноцитами и гистиоцитами (см. рис. 1, г), в толще капсулы также определялись микрофрагменты имплантата. Исследование коленного сустава у крыс не выявило признаков воспалительной реакции в окружающей имплантаты области вне зависимости от природы материала и срока исследования, за исключением 5-х суток, когда у животных обеих групп перифокально определялись утолщение пласта синовиальных клеток и слабо выраженный фиброз за счет реакции на сдавление, которые ограничивались только областью контакта с гидрогелем, а суставные поверхности и мениски оставались неизменными. К концу срока исследования (90-е сутки) была отмечена умеренная макрофагальная реакция в зоне контакта с исследуемым материалом при отсутствии признаков воспаления (см. рис. 1, д, е). Кроме того, наблюдалось врастание соединительной ткани в имплантат, содержащий БЦ (см. рис. 1, е) с его фрагментацией (см. рис. 1, ж). При имплантации исследуемых образцов в глубокий дефект хряща коленного сустава кроликов на 5-е сутки на их поверхности сохранялся дефект хряща. При этом по боковым поверхностям имплантата, содержащего РЦ, было отмечено плотное прилежание сформированных стенок экспериментальной полости. В субхондральной области обнаружено формирование тонкой прерывистой капсулы с небольшими очагами лимфоплазмоцитарной инфильтрации и макрофагальной реакции. Вокруг образца, содержащего БЦ, зона реактивных изменений была более выражена: граница с окружающими тканями представлена тканевым детритом, умеренная воспалительная полиморфно-клеточная инфильтрация определялась почти на всем протяжении с очагами формирования грануляционной ткани. На 14-е сутки после имплантации были отмечены хорошая механическая фиксация и интеграция всех образцов искусственного хряща с сохранившимися костными балками, а перифокальное воспаление практически не определялось. В глубине вокруг имплантатов, вне зависимости от их природы, определялась тонкая различной толщины оболочка из созревающей грануляционной ткани. Поверхность имплантатов, содержащих РЦ, в области дефекта имела эозинофильную фибриноидную прослойку. Непосредственно вдоль поверхности образцов, содержащих БЦ, были разрастания созревающей грануляционной ткани. На 45-е сутки признаков токсического воздействия образцов на хрящ не отмечено. Обнаружено погружение одного образца, содержащего РЦ, вглубь дефекта. В зоне суставной поверхности имплантата определялись признаки краевой регенерации хряща. В глубине вокруг имплантата определялась тонкая капсула с макрофагальной реакцией, кроме того отмечались небольшие очаги воспалительной инфильтрации лимфоцитами, плазматическими клетками, макрофагами, более отчетливо выраженные в глубоких отделах (рис. 2, а). В области дефекта суставной поверхности другой образец, содержащий РЦ, плотно контактировал с хрящом без фиброзной прослойки (см. рис. 2, б). В глубине препарата вокруг имплантата была сформирована тонкая капсула с оссификацией. Воспалительная и макрофагальная реакция в поверхностных и боковых отделах практически отсутствовала. В указанные сроки на поверхности имплантатов, содержащих БЦ, были сформированы связанные с хрящом тонкие волокнистые бесклеточные мембраны. В глубоких слоях исследуемые образцы окружала костно-фиброзная капсула с тонкой прослойкой волокнистой соединительной ткани с очагами макрофагальной реакции на границе с имплантатом, костные балки были ориентированы вдоль него и определялись не на всем протяжении (см. рис. 2, в). На 90-е сутки хрящ на границе с имплантатом, содержащим РЦ, был практически неизменённым (см. рис. 2, г). Тестируемый материал был отграничен от хряща и субхондральной пластинки тонкой фиброзной прослойкой. Внутрикостно определялась толстая капсула с продолжающимся остеогенезом (см. рис. 2, е). В отличие от образцов, содержащих РЦ, в хряще по периферии имплантата, содержащего БЦ, на 90-е сутки определялись признаки атрофии (см. рис. 2, д). Субхондральная костная ткань была не изменена, образец, находящийся с ней в контакте, не имел фиброзной прослойки (см. рис. 2, ж). Обсуждение полученных данных. Более чем 30-летний опыт применения ПААм в виде жидких косметических составов для контурной пластики свидетельствует, что современные материалы на его основе нетоксичны, гипоаллергенны, не обладают тератогенным свойством, эмбриотоксичностью и мутагенностью, а также практически не подвержены биодеградации [7]. Однако существуют публикации о том, что, несмотря на отсутствие миграции гидрогеля, частицы ПААм были найдены в перифокально расположенных макрофагах и гигантских клетках, скопления которых авторы расценивают как повышенную реакцию на инородное тело и бактериальные инфекции в течение 1-го года после имплантации [15]. Существенно, что в данном исследовании был использован совсем другой вид гидрогелей, содержащих ПААм: это очень жесткие взаимопроникающие полимерные сетки, в которых цепи ПААм переплетены с целлюлозными цепями [2]. Они по физическим характеристикам существенно отличаются от жидких косметических составов, содержащих ПААм, что делает невозможным экстраполяцию имеющихся в научной литературе данных о биосовместимости и токсичности жидких косметических составов на исследованные образцы. Разработанный в Институте высокомолекулярных соединений РАН новый класс гидрогелей не имеет аналогов [2, 6]. В литературе отсутствуют какие-либо данные о биосовместимости и перифокальных реакциях при имплантации таких гидрогелей, за исключением полученных нами. Промышленный ПААм обычно содержит остаточные количества мономера, который считается токсичным соединением, ис 2005 г. его возможное содержание в косметических средствах ограничено до 5 ppm (0,0005%) [4], в изученных образцах ПААм-гидрогеля, содержащего РЦ и БЦ, данный показатель был менее 0,1 ppm, что позволяло предположить нетоксичность образцов еще до начала эксперимента in vivo. В настоящее время оптимальным для имплантации может считаться материал, вызывающий минимальную макрофагальную и пролиферативную реакции окружающих тканей, в результате которых формируется как можно более тонкая капсула вокруг имплантата [3]. В проведенной работе были получены результаты, свидетельствующие о хорошей биосовместимости исследованных материалов. Умеренная перифокальная воспалительная реакция определялась вокруг образцов только в ранние сроки (5-еи 14-е сутки) после имплантации в мышцы и была более выражена при использовании материала, содержащего БЦ. В целом, имплантация гидрогелей обоих видов в мягкие ткани в ранние сроки вызывала развитие грануляционной ткани с последующим превращением в тонкую фиброзную капсулу, что можно считать нормальной реакцией на биосовместимый материал [1]. Кроме того, на 90-е сутки исследования выявлены признаки интеграции исследуемых материалов вне зависимости от их природы в мышцах и одного из образцов, содержащего БЦ, в полости коленного сустава, что, по-видимому, обусловлено явлениями фагоцитоза и краевой резорбции исследуемых материалов макрофагами. Следует также указать, что ни в одном из проведенных опытов не были замечены дегенеративные или некротические изменения тканей, окружающих имплантаты, что также подтверждает их хорошую биосовместимость [1]. Изученные гидрогелевые имплантаты, содержащие РЦ и БЦ, помещенные в область глубокого дефекта хряща коленного сустава кролика, на протяжении 90 сут эксперимента эффективно функционировали в качестве протеза хряща, обеспечивая полное сохранение функции оперированной конечности. В ранние сроки наблюдения (5-еи 14-е сутки) перифокальная воспалительная реакция была более выражена вокруг образцов, содержащих БЦ. По-видимому, это может быть проявлением реакции тканей на присутствие остаточного количества бактериального липополисахарида, так как БЦ выращивают, используя грамотрицательные бактерии Acetobacter xylinum [2]. Такие перифокальные реакции, как формирование грануляционной ткани, инкапсуляция и оссификация капсулы вокруг имплантатов, сопоставимы по выраженности и срокам вне зависимости от природы тестируемых образцов гидрогелей. На 45-е сутки реакция тканей на изученные образцы в целом была однотипной: инкапсуляция имплантатов с формированием тесно прилежащей к ним тонкой костно-фиброзной капсулы. Макрофагальная реакция с 45-х суток экспериментов была слабо выражена во всех наблюдениях. Однако она чаще встречалась и значительнее проявлялась у экспериментальных животных при имплантации образцов, содержащих БЦ. Указанные изменения позволяют предположить, что более выраженная воспалительная реакция в ранние сроки наблюдения при использовании образцов, содержащих БЦ, дает положительный эффект, приводящий к 45-м суткам эксперимента к менее выраженной воспалительномакрофагальной реакции и более заметной оссификации капсулы вокруг имплантатов в глубоких отделах созданных дефектов суставного хряща. К концу срока наблюдения воспалительная реакция в окружающих имплантаты тканях отсутствовала. Формирование тонкой костно-фиброзной капсулы, отсутствие реакции хряща в области контакта с изучавшимися материалами, а также тесный контакт исследуемых образцов с субхондральной костью также свидетельствуют об их совместимости с костной и хрящевой тканями. Таким образом, в результате эксперимента мы получили устойчивую систему: с одной стороны, ПААм-гидрогель, как протез для замещения дефектов хряща, с другой - формирование перипротезной мембраны с хорошей фиксацией, в том числе за счет поверхностной фрагментации имплантата и врастания в образовавшиеся дефекты соединительной ткани. Фрагментация, возможно, была связана с частичными механическими повреждениями поверхности при изготовлении и установке имплантата. Однако наличие включений частиц гидрогеля в цитоплазму макрофагов является признаком перипротезной тканевой реакции, что в совокупности с полученной хорошей фиксацией имплантата и стойким протезированием дефекта хряща мы расценили как явление эффективной интеграции. Ограничением данного исследования является срок наблюдения (3 мес со дня имплантации). Полученные результаты свидетельствуют о хорошей биосовместимости обоих видов исследованных гидрогелей, содержащих РЦ, БЦ и ПААм, с тканями экспериментальных животных (лабораторных крыс и кроликов). Исследуемые образцы представляются перспективными для дальнейшего изучения возможностей их использования при протезировании глубоких дефектов суставного хряща в эксперименте с более длительными сроками наблюдения. Кроме того, необходимо дать оценку количества остаточного бактериального липополисахарида в образцах гидрогеля, содержащего БЦ и ПААм, для предупреждения возможного развития макрофагальных реакций на имплантат.

作者简介

S. Bozhkova

R. R. Vreden Russian Research Institute of Traumatology and Orthopedics

Email: clinpharm-rniito@yandex.ru
Research Department of Prevention and Treatment of Wound Infection

A. Buyanov

RAS Institute of Macromolecular Compounds

Email: buyanov799@gmail.com
Laboratory of Hydrophilic Polymers

A. Kochish

R. R. Vreden Russian Research Institute of Traumatology and Orthopedics

Research Department of Prevention and Treatment of Wound Infection

V. Rumakin

R. R. Vreden Russian Research Institute of Traumatology and Orthopedics

Research Experimental-Morphological Department

A. Khripunov

RAS Institute of Macromolecular Compounds

Laboratory of Hydrophilic Polymers

G. Netyl’ko

R. R. Vreden Russian Research Institute of Traumatology and Orthopedics

Research Experimental-Morphological Department

R. Smyslov

RAS Institute of Macromolecular Compounds

Laboratory of Luminescence, Relaxational and Electrical Properties of Polymer Systems

A. Afanasyev

R. R. Vreden Russian Research Institute of Traumatology and Orthopedics

Research Department of Prevention and Treatment of Wound Infection

Ye. Panarin

RAS Institute of Macromolecular Compounds; St. Petersburg State Polytechnical University

Email: office@spbstu.ru
Laboratory of Hydrophilic Polymers; Department of Medical Physics and Bioengineering

参考

补充文件