STRUCTURAL ORGANIZATION AND INTERRELATION OF INTRAPANCREATIC GANGLIA AND MYENTERIC NERVOUS PLEXUS IN THE EARLY STAGES OF POSTNATAL ONTOGENESIS IN RATS

全文:

Известно, что регуляция и реализация многих функций поджелудочной железы (ПЖ) осуществляется не только гуморальным [1], но и нейрогенным путем [8, 18]. ПЖ, состоящая из двух секреторных отделов: экзокринного, участвующего в процессах пищеварения, и эндокринного, представленного панкреатическими островками (ПО), богато иннервируемый орган. В некоторых ПО обнаружены нервные клетки, пучки безмиелиновых нервных волокон, синаптические эфферентные и афферентные окончания [4, 5, 15, 16], вследствие этого многие авторы ПО называют «нейроинсулярными комплексами» и подразделяют их на несколько типов [9]. Парасимпатические элементы ПЖ у взрослых млекопитающих представлены нейронами интрамуральных ганглиев, отростки которых входят в состав постганглионарных безмиелиновых волокон [13], и нервными проводниками, приходящими в ПЖ из различных отделов головного и спинного мозга, а также спинномозговых ганглиев. Среди них миелиновые эфферентные (преганглионарные), афферентные проводники и безмиелиновые афферентные волокна С-типа [10, 14]. немаловажную роль в развитии ПЖ играет симпатический отдел нервной системы [7]. Симпатические нервные элементы у взрослых млекопитающих и человека представлены пучками нервных волокон, их терминальные структуры участвуют, главным образом, в иннервации сосудистого русла ПЖ [6, 8]. Передача нервных стимулов к мишеням в ПЖ осуществляется не только при помощи классических нейромедиаторов (ацетилхолина, катехоламинов), но и регуляторных пептидов, обнаруженных в последние десятилетия с помощью иммуногистохимических методов [18]. Считается, что парасимпатические нервные волокна стимулируют синтез инсулина B-клетками, а симпатические волокна опосредованно через А-клетки ингибируют секреторную активность В-клеток [16]. При этом роль нейрорегуляторных пептидов, сочетаннолокализующихся с медиаторами в парасимпатических и симпатических волокнах, остается до конца не ясной. С помощью иммуногистохимических маркёров установлено сходство этих пептидов с маркерами эндокриноцитов ПО, выявлены их изменения при патологии ПЖ [5, 6, 17]. Многие вопросы, касающиеся структуры, физиологии и цитохимии клеток интрапанкреатических ганглиев [11, 13], также требуют решения. Исходя из известных фактов общности источника происхождения эпителиев двенадцатиперстной кишки (ДПК) и ПЖ из энтодермы и формирования закладки ПЖ в виде эпителиального выпячивания из переднего отдела кишки на ранних стадиях развития, можно предположить, что между обоими органами (ДПК и закладкой ПЖ) должны существовать временные морфологические взаимосвязи. Цель настоящей работы - с помощью нейрональных иммуногистохимических маркеров изучить морфологические особенности нервных аппаратов ДПК и ПЖ и их взаимоотношения у крыс в ранний постнатальный период. Материал и методы. Работа выполнена на новорожденных крысах линии Вистар (n=4) в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ № 775 от 12.08.1977 г. МЗ СССР). Дольки ПЖ и фрагменты ДПК фиксировали в цинк-этанол-формальдегиде [3]. После заливки в парафин по стандартной методике изготавливали срезы толщиной 10 мкм, часть из которых окрашивали толуидиновым синим. Для селективного выявления синаптических терминалей использовали иммуногистохимическую реакцию на синаптофизин (СФ) - интегральный мембранный гликопротеин c молекулярной массой 38 килодальтон, который локализуется в пресинаптических пузырьках синапсов ЦНС и ПНС [2]. Для этого были применены моноклональные мышиные антитела (Sy38, DAKO, Дания). Для идентификации катехоламинергических структур симпатической нервной системы применяли поликлональные кроличьи антитела к тирозингидроксилазе (ТГ) (Abcam, Великобритания). Для выявления парасимпатических стволов, нервных пучков, нервных сплетений, ганглиев и эндокриноцитов ПО использовали поликлональные кроличьи антитела к белку ПГП 9,5 (protein gene product 9.5) (Spring Bioscience, США). Для выявления пролиферирующих клеток применяли мышиные моноклональные антитела к белку пролиферирующих клеток - PCNA (DAKO, Дания). В качестве вторичных реагентов использовали реактивы из набора Reveal Polyvalent HRP DAB Detection System SPD- 015 (Spring Bioscience, США) и EnVision+System Labeled Polymer-HRP Anti-Mouse (K4001) (Dako, Дания). Анализ клеточных элементов проводили на цифровых изображениях, полученных при помощи микроскопа Leica DM750 (Leica, Германия) и цифровой камеры Leica ISS50 (Leica, Германия) при увеличении 400 и 1000. Для определения размеров клеток использовали программу ImagaT NIH, США. Результаты исследования. Иммуногистохимическая реакция на ПГП 9,5 дала возможность выявить у новорожденных крыс как нервные, так и эндокринные клеточные элементы. Этот маркер позволил исследовать общую топографическую и структурную организацию нервного аппарата в ДПК и развивающихся ПО. На поперечных срезах ДПК можно было отчетливо видеть общий план строения межмышечного нервного сплетения. Оно расположено в виде кольца и представлено многочисленными ПГП 9,5-иммунопозитивными скоплениями нервных клеток, связанными друг с другом тонкими пучками аксонов (рис. 1, а). Это сплетение залегает между двумя слоями гладких мышечных клеток: наружным тонким и внутренним более толстым. Нервные клетки в сплетении располагаются либо в виде тяжей, либо обособленных узелков - микроганглиев. Последние состоят из различного числа (от 5 до 10 и более) нейральных клеточных элементов различной дифференцировки: нейробластов, молодых и зрелых нейронов и находятся на некотором расстоянии друг от друга. Размеры нервных клеток варьируют: от 9×13,5 до 15,5×27,5 мкм, их форма разнообразна. Перикарионы окрашиваются при реакции на ПГП 9,5 в темно-коричневые тона, а ядра выглядят более светлыми. Судя по количеству дендритных холмиков, многие из этих клеток являются мультиполярными. Однако ход дендритов и аксонов не удается проследить, так как тела клеток плотно прилежат друг к другу и замаскированы пучками аксонов. При окраске толуидиновым синим видно, что в зависимости от зрелости нервные клетки имеют разный объем цитоплазмы, и их ядра, расположенные эксцентрично, круглой или овальной формы. Дольки ПЖ находятся в тесной связи со стенкой ДПК и при окраске толуидиновым синим в них хорошо различима интерстициальная рыхлая соединительная ткань со всеми присущими ей волокнистыми и клеточными элементами и кровеносными сосудами. В некоторых местах на тангенциальных срезах можно проследить связь соединительной ткани долек ПЖ с серозной оболочкой ДПК. Наибольшая часть паренхимы долек ПЖ представлена скоплениями экзокринных клеток, находящихся на разных стадиях формирования ацинусов. Между ацинусами и дольками видны прослойки соединительной ткани. В экзокринной части ПЖ встречаются многочисленные, диффузно расположенные отдельные эндокриноциты и их группы разных размеров. Использованные иммуногистохимические методы выявления ПГП 9,5 и СФ позволили одновременно избирательно выявлять нервные явлении реакции, их удается идентифицировать структуры и эндокриноцины ПЖ. Те и другие на по ряду морфологических признаков - по форме светлом фоне среза окрашиваются в коричневые и размерам. Эндокринные элементы представлетона (см. рис. 1, б). Несмотря на сходство в про-ны отдельными клетками или образуют группы в виде тяжей и островков. Клетки имеют размеры до 8-9 мкм, мелкозернистую ПГП 9,5-иммунопозитивную (ПГП 9,5+) цитоплазму, округлое светлое ядро диаметром 4-6 мкм. Нередко среди перечисленных клеточных образований встречаются выводные протоки, выстланные однослойным столбчатым эпителием, в составе которого также встречаются отдельные ПГП 9,5+-эндокриноциты. В некоторых участках ПЖ можно видеть отходящие от выводных протоков эпителиальные боковые почки с концевыми шаровидными структурами (размером от 100-150 мкм), сходные с ПО (см. рис. 1, д). Наличие этих многоклеточных ПГП 9,5+-структур в паренхиме ПЖ у новорожденных крыс свидетельствует об интенсивном гисто-и морфогенезе не только экзокринного, но и эндокринного отделов, включая ПО. Реакция на PCNA подтвердила наличие пролиферативных процессов не только в экзокринной, но и эндокринной части ПЖ, а также в эндотелии сосудов развивающегося микроциркуляторного русла, клеточных элементах соединительной ткани, наконец, в микроганглиях и вокруг них. С помощью иммуногистохимических методов выявления ПГП 9,5 и ТГ удалось обнаружить обильную иннервацию развивающихся тканей ПЖ. Установлено, что ее источником является хорошо выраженное уже в этот срок межмышечное нервное сплетение ДПК, часть которого с вентральной стороны ее стенки в составе соединительной ткани и общих артериальных сосудов проникает в развивающуюся паренхиму ПЖ. Сплетение представлено узкопетлистой сетью пучков нервных волокон и многочисленными, характерными для ДПК, микроганглиями (см. рис. 1, а). В составе микроганглиев нервного сплетения ПЖ насчитывается различное число (от 3-4 до 10-17) мелких (до 12-13,5 мкм) нервных клеток. Сравнительный анализ показал, что на этой стадии развития они по размерам, окраске, форме, реакции на ПГП 9,5 не отличаются от таковых в межмышечном нервном сплетении ДПК (см. рис. 1, в, г). Нервные клетки выявляются по ходу следования тонких пучков нервных волокон, а также в местах их пересечения. В зависимости от этого форма нейронов варьирует от округлой или шаровидной до вытянутой и грушевидной. Отдельные небольшие группы нейронов и их отростки выявляются между ацинусами, прослеживаются вдоль кровеносных сосудов, но чаще они близко прилежат к группам эндокриноцитов и формирующимся ПО. Иногда встречаются небольшие группы нейронов грушевидной формы с 1-2 отходящими от тела ветвящимися отростками, варикозные терминальные веточки которых направляются к отдельным скоплениям эндокриноцитов или окружают ПО. На препаратах, окрашенных толуидиновым синим, хорошо видны цитологические особенности нейронов ПЖ. Одиночные клетки, небольшие их группы (от 2 до 7) и микроганглии (от 15 до 20 клеток) встречаются в междольковой соединительной ткани, вблизи ацинусов, сосудов, выводных протоков и формирующихся ПО. Нейроны имеют от 10 до 13,5 мкм в диаметре, округлое, чаще сферическое, пузырьковидное, светлое ядро с одним крупным ядрышком. Только некоторые малодифференцированные клетки имеют ядра с преобладанием гетерохроматина. У части клеток цитоплазма светлая, хроматофильное вещество еще слабо выражено. Объем цитоплазмы варьирует: у одних нейронов она равномерно окружает центрально расположенное ядро, у других имеет вид полумесяца. В отличие от формирующихся нейронов ядра как экзокринных, так и эндокринных секреторных клеток ПЖ в большинстве случаев гиперхромны и имеют меньшие размеры. Отличаются эти клетки и по структуре цитоплазмы. У нейронов цитоплазма содержит пылевидное хроматофильное вещество, а у всех секреторных клеток в ней выявляются многочисленные крупные и мелкие секреторные гранулы. В ПЖ многочисленные СФ+-аксоны нейронов участвуют не только в образовании сплетений, но и непосредственно иннервируют экзо-и эндокринную части ПЖ. Часто можно видеть, как аксоны покидают сплетение и выходят из него, меняют направление, ветвятся и следуют между клетками экзокринной и эндокринной частей ПЖ. Нередко видно, как претерминальные и терминальные варикозные волокна тесно прилежат к отдельным экзокриноцитам и ацинусам, обособленным эндокриноцитам и формирующимся ПО, а иногда проникают внутрь. Некоторые находятся в тесной связи c сосудами и выводными протоками. Обращает на себя внимание высокая концентрация нервных структур и особенно - нервных сплетений в ПЖ. Часто единичные нервные клетки, их группы или микроганглии встречаются среди ацинусов и/или вблизи формирующихся ПО. На тех же самых срезах, окрашенных толуидиновым синим, при больших увеличениях микроскопа бывает хорошо видно, что группы нейронов и микроганглии отграничены от эндокриноцитов тонкими прослойками соединительной ткани, а часть микроганглиев имеют уже собственную оболочку (см. рис. 1, е). При изучении симпатической иннервации ПЖ с помощью иммуногистохимической реакции на ТГ выяснилось, что уже у новорожденных крыс в ней, кроме многочисленных ПГП 9,5+ нервных структур, которые мы рассматриваем как парасимпатические, обнаружено относительно небольшое количество ТГ+-стволиков, нервных волокон и их пучков вблизи сосудов. Все они селективно окрашены в желто-коричневый цвет. Ни нейронов, ни микроганглиев, синтезирующих катехоламины, в ПЖ нет. Неожиданным было обнаружение в ганглиях специализированных симпатических нервных окончаний. Они образованы тонкими пучками ТГ+-аксонов, которые входят внутрь микроганглия, ветвятся и заканчиваются терминальными варикозными веточками (см. рис. 1, ж). Последние формируют вокруг тел некоторых нейронов рыхлую сеточку с четкообразными структурами в виде колечек и различных размеров бутонов. Применение нейрогистологических и иммуногистохимических реакций позволило выявить морфологическое сходство и топографическую взаимосвязь микроганглиев ПЖ и межмышечного сплетения (рис. 2). Обсуждение полученных данных. Применение в настоящем исследовании комплекса нейрональных иммуногистохимических маркеров позволило выявить обилие парасимпатических и симпатических элементов ДПК и ПЖ уже у новорожденных крыс. Более обильная иннервация ПЖ по сравнению с таковой ДПК согласуется с данными других исследователей [4]. Полученные нами данные о парасимпатической природе нейронов интрапанкреатических ганглиев и парасимпатической иннервации ПО сходны сходны с таковыми M. T.Liu и соавт. [13], которые исследовали морфологические, нейрохимические и электрофизиологические свойства нейронов ПЖ морской свинки. Используя иммуногистохимические реакции на холинацетилтрансферазу (ХАТ), они установили, что 86% нейронов ганглиев ПЖ иммунопозитивны, ХАТнегативные нейроны - результат методического артефакта. Выявление нами парасимпатических нейронов в ПЖ при помощи ПГП 9,5 подтверждает, что этот маркер содержится в холинергических структурах. При использовании реакции на ТГ для выявления симпатических элементов в ПЖ у крысы были обнаружены только немногочисленные стволики и пучки нервных волокон. Можно было проследить их концевые синаптические структуры вокруг артериальных и венозных сосудов экзо-и эндокринного отделов ПЖ и синаптические окончания в микроганглиях. Симпатические нейроны нами, как и большинством других исследователей [10], в ПЖ не были обнаружены, в том числе и у взрослых крыс, и у человека [5, 6]. При анализе работ, посвященных исследованию нервных клеток ганглиев ПЖ и ганглиев энтеральной системы у взрослых животных разных видов, отмечено их морфологическое и биохимическое сходство [10]. Имеются данные, что по своим биохимическим характеристикам ганглии в сплетениях ПЖ и желчного пузыря морской свинки [11] обнаруживают сходство с ганглиями сплетений энтеральной нервной системы и, вероятно, также могут быть включены в общую иннервацию пищеварительного тракта через систему панкреатических и симпатических нервных связей. О сходстве свидетельствует наличие в ганглиях ПЖ и в стенке кишки нейронов моноаминового типа В-оксидазы, NO-синтазы (NOS), многих нейропептидов, характерных для нервных элементов обоих сплетений [11, 18]. Имеются немногочисленные данные о наличии в ПЖ у крысы, кроме парасимпатических и симпатических, также серотонинергических нервных волокон [11, 12]. Серотонинергический нервный фенотип, как известно, характерен для энтеральной нервной системы и редко встречается в экстрамуральных ганглиях ПНС. A. L. Kirshgessner и M. D. Gershon [10] предполагают, что ганглии ПЖ могут получать иннервацию от холинергических нейронов, расположенных в межмышечном сплетении желудка и ДПК, аксоны которых образуют возбудимые никотиновые синапсы на телах интрапанкреатических нейронов, а также от серотонинергических нейронов, локализованных в межмышечном сплетении. Поскольку в ганглиях ПЖ отсутствуют тела серотонинергических нейронов, в отличие от ДПК, то авторы полагают, основываясь на использовании метода ретроградной метки, что серотонинергические волокна имеют энтеральное происхождение. Предполагается, что аксоны серотонинергических нейронов, встречающиеся в ПЖ, образуют ингибиторные или тормозные аксо-аксональные синапсы в ее ганглиях. По мнению этих авторов, серотонин также причастен к регуляции механизмов синтеза амилазы. Предположительно целью серотонинергических нервных волокон является стимуляция холинергических аксонов, которые побуждают экзокринные панкреатоциты к секреции. По нашему мнению, вопрос о наличии серотонинергической иннервации ПЖ остается до сих пор дискуссионным. Что же касается вопроса о механизмах, ингибирующих секрецию ацетилхолина парасимпатическими нейронами ПЖ, то можно предположить, что эту роль выполняют обнаруженные нами ТГ+-терминали перицеллюлярных симпатических (катехоламинергических) аксонов, синапсы которых локализуются на ПГП 9,5+-дендритах клеток ганглиев. Таким образом, с помощью иммуногистохимических реакций на ПГП 9,5, СФ, ТГ, PCNA и окраски толуидиновым синим показано, что часть межмышечного сплетения из стенки ДПК врастает в развивающуюся ПЖ. Установлена не только связь между ганглиозными сплетениями ПЖ и межмышечным сплетением ДПК, но подтверждено морфологическое и биохимическое сходство его микроганглиев и интрамуральных ганглиев ПЖ. Установлено, что абсолютное большинство дифференцирующихся нейронов и пучков аксонов изученных сплетений относятся к парасимпатическому отделу нервной системы. Катехоламинергические нейроны в ПЖ отсутствуют, а приходящие в орган извне пучки симпатических проводников малочисленны и участвуют в основном в иннервации кровеносных сосудов. Установлены особенности строения и распределения микроганглиев и образуемых ими нервных сплетений в ПЖ, выявлены взаимоотношения аксонов нервных клеток с экзокринными и эндокринными ее элементами. Впервые с помощью комплекса нейроиммуногистохимических реакций на 9,5, СФ и ТГ в ганглиях ПЖ у новорожденных крысят обнаружены 2 типа нервных сплетений, образующих вокруг нервных клеток парасимпатические и симпатические нервные окончания.

作者简介

Ye. Chumasov

St. Petersburg Institute of Experimental Medicine; St. Petersburg State Academy of Veterinary Medicine

Email: ua1ct@mail.ru

Ye. Petrova

St. Petersburg Institute of Experimental Medicine

Email: iemmorphol@yandex.ru

D. Korzhevskiy

St. Petersburg State University

Email: dek2@yandex.ru

参考

补充文件