AGE-RELATED PECULIARITIES OF HISTOLOGICAL STRUCTURE AND CELLULAR COMPOSITION OF CONJUNCTIVA-ASSOCIATED LYMPHOID TISSUE IN PIGS

全文:

Лимфоидная ткань, ассоциированная с конъюнктивой (ЛТАК), сходна с лимфоидной тканью пищеварительного тракта и бронхов [9, 10]. Она лучше исследована у человека и кролика [6-8], чем у других видов. У человека она содержит все компоненты, необходимые для выработки полноценного иммунного ответа [6, 7, 10]. Сравнительное гистологическое исследование конъюнктивы у 15 видов млекопитающих установило наличие в ней лимфоидных узелков у кроликов, хорьков, морских свинок, кошек, собак, свиней, овец, коров, макак-резусов, бабуинов и людей, причем их количество зависело от вида животного. В конъюнктиве у мышей и крыс лимфоидная ткань обнаружена не была [3]. У мышей она имелась только в мигательной перепонке [10]. При исследовании ЛТАК иммуногистохимическими методами в ней обнаружены IgA-, а также в небольшом количестве - IgM-позитивные плазматические клетки [7]. В настоящее время отсутствуют исследования, посвященные морфологическим изменениям ЛТАК в зависимости от возраста животных. Цель настоящей работы - исследование структуры ЛТАК у свиней и выявление в ней популяций лимфоцитов, а также бластных клеток в возрастном аспекте. Материал и методы. Материал для исследования брали во время забоя поросят и свиней в убойном пункте, расположенном недалеко от г. Бишкек. После забоя 18 голов поросят и свиней все их органы были подвергнуты детальному осмотру для исключения каких-либо патологических изменений. Объектами исследования служили конъюнктивы нижных и верхних век глаз 18 голов поросят и свиней крупной белой породы, в том числе 3 головы - 5-7-суточные поросята (все самки), 3 головы - 2-месячные поросята (2 самца, 1 самка), 6 голов - 6-месячные подсвинки (4 самки, 2 самца) и 6 голов - 12-месячные свиньи (4 самки, 2 самца). При взятии материала соблюдали общепринятые требования международной Хельсинкской декларации о гуманном отношении к подопытным животным. Сбор материала и часть гистологических исследований проведены на кафедре ветеринарно-санитарной экспертизы, гистологии и патологии Кыргызского национального аграрного университета им. К. И. Скрябина, а часть гистологических, гистохимических и иммуногистохимических исследований - в Институте ветеринарной патологии факультета ветеринарной медицины Гиссенского университета им. Юстуса Либиха (Германия) при грантовой поддержке ДААД (Германская Служба Академических Обменов). Верхние и нижние веки глаз поросят и свиней сразу же после забоя и осмотра фиксировали в 4% водном растворе нейтрального формалина, после чего заливали в парафин обычным способом. Готовили серийные срезы толщиной 5 мкм на ротационном микротоме RM 2255 (Leica Biosystems Nussloch, Германия). Гистологические препараты окрашивали гематоксилином - эозином и ставили ШИК-реакцию для выявления бокаловидных клеток и докрашивали красителем Папаниколау (1:10). Для выявления Т-, В-лимфоцитов и оценки пролиферации клеток использовали иммуногистохимические реакции. Применяли следующие первичные антитела и стандартные иммуногистохимические методы: поликлональные кроличьи антитела к маркеру Т-лимфоцитов CD3 (DakoCytomation, Дания); моноклональные мышиные антитела к маркеру В-лимфоцитов CD79a - очищенные (Acris Antibodies GmbH, Германия); моноклональные мышиные антитела к ядерному антигену пролиферирующих клеток (PCNA) (DakoCytomation, Дания). Для визуализации реакций применяли: 1) АВС-метод - с использованием авидин-биотиновых комплексов; 2) пероксидазно-антипероксидазный (ПАП) метод с 3,3-диамино-бензидин-тетрагидрохлорид дигидратом (ДАБ) (Fluka, Германия). В ходе проведения иммуногистохимических реакций параллельно осуществляли отрицательные контроли. Иммуногистохимические исследования проводили согласно протоколам фирм-производителей с применением специального планшета Coverplates, Shandon Racks, Thermo Scientific (Германия), предназначенного для ручного иммуногистохимического окрашивания. При положительной реакции CD3-позитивные клетки (Т-лимфоциты), CD79aпозитивные клетки (В-лимфоциты), клетки в состоянии пролиферации окрашивались в коричневый цвет. После проведения иммуногистохимических реакций срезы докрашивали гематоксилином. Препараты просматривали под бинокулярным микроскопом Nikon ECLIPSE 80 i с экраном (Nikon, Германия). Результаты исследования. Конъюнктива у 5-7-суточных поросят состоит из эпителиального и субэпителиального слоев (рис. 1, а). Эпителиальный слой представлен многослойным эпителием, состоящим из эпителиоцитов цилиндрической и кубической формы, а также бокаловидными клетками (см. рис. 1, б). Единичные лимфоциты встречаются между эпителиоцитами и в субэпителиальной соединительной ткани (см. рис. 1, а). Вокруг отдельных сосудов субэпителиального слоя и в их просвете встречаются единичные лимфоциты. Лимфоидные узелки в субэпителиальной соединительной ткани конъюнктивы отсутствуют. Иммуногистохимические исследования показали, что единичные CD3-позитивные лимфоциты располагаются в субэпителиальном слое, вокруг и в просвете отдельных сосудов и между эпителиоцитами конъюнктивы (см. рис. 1, в), тогда как CD79a-позитивные лимфоциты отсутствуют. У 2-месячных поросят незначительное количество лимфоидной ткани наблюдается в основном в тарзальной зоне конъюнктивы верхних и нижних век, а в своде и бульбарной зоне конъюнктивы лимфоидной ткани нет. В субэпителиальной соединительной ткани встречаются лимфоциты и плазматические клетки. Вокруг отдельных сосудов отмечается небольшое скопление лимфоцитов и плазматических клеток. Встречаются интраэпителиальные лимфоциты (рис. 2, а). Бокаловидных клеток в конъюнктиве у 2-месячных поросят больше, чем у 5-7-суточных поросят (см. рис. 2, б). Иммуногистохимические исследования показали, что популяция лимфоцитов в конъюнктиве у 2-месячных поросят представлена CD3-позитивными лимфоцитами (см. рис. 2, в) и CD79a-позитивными лимфоцитами (см. рис. 2, г). Вокруг отдельных сосудов субэпителиального слоя отмечается небольшое скопление CD3-позитивных лимфоцитов (см. рис. 2, в). Интраэпителиальные лимфоциты представлены CD3-позитивными клетками. У свиней 6- и 12-месячного возраста субэпителиальная ткань конъюнктивы содержит как лимфоциты и плазматические клетки, так и типичные лимфоидные узелки (рис. 3, а), которые в основном располагаются в тарзальной зоне конъюнктивы верхних и нижних век, а в своде и бульбарной зоне конъюнктивы имеется незначительное количество лимфоидных узелков или они единичны.Всубэпителиальном слое конъюнктивы лимфоидные узелки обычно единичны, но они могут располагаться и в виде мелких групп (обычно по 2-3) (см. рис. 3, в). Отдельные лимфоидные узелки содержат центр размножения. Лимфоидные узелки и лимфоидные клетки тесно взаимосвязаны с эпителием конъюнктивы, где создают ЛТАК (см. рис. 3, а). В субэпителиальном слое конъюнктивы и вокруг лимфоидных узелков встречаются венулы с высоким эндотелием, вокруг которых выявляются лимфоциты (см. рис. 3, б). В участках конъюнктивы, где под эпителием располагаются лимфоидные узелки, он истончен и инфильтрирован лимфоцитами, а количество бокаловидных клеток уменьшено, либо они отсутствуют (см. рис. 3, в). Иммуногистохимические исследования показали, что субэпителиальная ткань содержит как CD3-позитивные (см. рис. 3, г), так и CD79a-позитивные лимфоциты, из которых в основном состоят лимфоидные узелки (см. рис. 3, д). В центре размножения отдельных лимфоидных узелков отмечена пролиферация лимфобластов (см. рис. 3, е). Большинство CD3позитивных лимфоцитов располагаются вокруг лимфоидных узелков (см. рис. 3, г) или в межузелковых зонах. ЛТАК имеет В-зависимые зоны (лимфоидные узелки), состоящие из CD79aпозитивных лимфоцитов, иТ-зависимые зоны, расположенные вокруг лимфоидных узелков, или межузелковые зоны, состоящие из CD3-позитивных лимфоцитов. Обсуждение полученных дан ных. ЛТАК у свиней имеет такое же строение, как лимфоидная ткань, ассоциированная с другими слизистыми оболочками организма [9]. Для нее характерна специфическая структура, которая представлена конъюнктивальным эпителием, лимфоидными узелками и клетками в субэпителиальном слое. Проведенные морфологические исследования показали, что указанные структуры ЛТАК тесно взаимосвязаны между собой. Эта структура у свиней морфологически и по расположению имеет сходство с ЛТАК у человека [6, 7] и различных видов животных [2, 3, 5, 8, 10]. Ранее было показано, что в конъюнктиве у свиней имеются лимфоидные узелки [3]. Нами впервые исследована структура ЛТАК у свиней и описаны возрастные изменения в ней. Гистологически ЛТАК у поросят в возрасте 5-7 сут морфологически сходна с таковой у новорожденных кроликов и индеек [4]. Используя иммуногистохимические методы, нами впервые у поросят и свиней исследованы популяция лимфоцитов и пролиферация лимфобластов в ЛТАК в возрастном аспекте. Первичные антитела к маркерам CD3, CD79аи PCNA, соответственно, дали положительные реакции с Т-, В-лимфоцитами и бластными клетками. ЛТАК у свиней содержала CD3-позитивные лимфоциты, CD79а-позитивные лимфоциты, но в возрасте 5-7 сут CD79а-позитивные лимфоциты отсутствовали. В центрах размножения лимфоидных узелков ЛТАК была отмечена пролиферация лимфобластных клеток. Аналогичные иммуногистохимические исследования, направленные на выявление Т-иВ-лимфоцитов в ЛТАК с применением соответствующих первичных поли-и моноклональных антител, были проведены у человека [6-8], кошек [5, 6], грызунов [1] и бабуинов [2]. Места расположения Т-иВ-лимфоцитов в ЛТАК у свиней аналогичны таковым у отмеченных выше видов. Таким образом, совокупность полученных результатов морфологического исследования ЛТАК у свиней позволяет заключить: 1) ЛТАК у свиней в целом имеет структуру, подобную лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистыми оболочками у животных. Также ей свойственна специфическая структура, включающая в себя лимфоидные клетки и узелки, которые ассоциированы с конъюнктивальным эпителием; 2) у новорожденных поросят ЛТАК слабо развита и представлена единичными лимфоцитами. В процессе роста и развития поросят идет поэтапное формирование ЛТАК, которое характеризуется постепенным увеличением количества лимфоидных клеток и их скоплением, а также образованием лимфоидных узелков; 3) ЛТАК у свиней содержит Т-иВ-лимфоциты, тогда как в ЛТАК у поросят в возрасте 5-7 сут В-лимфоциты отсутствуют. В центрах размножения лимфоидных узелков ЛТАК отмечена пролиферация лимфобластных клеток; 4) клеточный состав лимфоидных узелков представлен В-лимфоцитами. Большинство Т-лимфоцитов расположены вокруг лимфоидных узелков или в межузелковых зонах ЛТАК; 5) ЛТАК у свиней является местной иммунной системой, которая содержит все структуры и клетки, необходимые для формирования иммунной реакции и защиты парокулярных тканей. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: З.К.К., К.С.А. Сбор и обработка материала: З.К.К., А.Ш.И., М.Р. Статистическая обработка данных: Анализ и интерпретация данных: З.К.К., К.С.А., А.Ш.И. Написание текста: З.К.К., К.С.А., А.Ш.И., М.Р. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

作者简介

A. Irgashev

Kyrgyz K. I. Skryabyn National Agrarian University

Email: irgasheva@mail.ru
Department of Veterinary Sanitary Expertise, Histology and Pathology 68 Mederova St, Bishkek 720005, Kyrgyz Republic

Z. Kalandarova

Kyrgyz K. I. Skryabyn National Agrarian University

Email: zakiaoph@mail.ru
Department of Veterinary Sanitary Expertise, Histology and Pathology 68 Mederova St, Bishkek 720005, Kyrgyz Republic

K. Arbayev

Kyrgyz K. I. Skryabyn National Agrarian University

Department of Veterinary Sanitary Expertise, Histology and Pathology 68 Mederova St, Bishkek 720005, Kyrgyz Republic

M. Reinacher

Justus-Liebig-University

Email: manfred.reinacher@vetmed.uni-giessen.de
Department of Veterinary Pathology 96 Frankfurter Str., Giessen 35392, Germany

参考

补充文件