КЛЕТОЧНЫЙ СОСТАВ ЛИМФОИДНЫХ УЗЕЛКОВ СТЕНКИ ТРАХЕИ И НЕВРОЛОГИЧЕСКАЯ СИМПТОМАТИКА У КРЫС С РАЗЛИЧНОЙ ПРОГНОСТИЧЕСКОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ К ЭМОЦИОНАЛЬНОМУ СТРЕССУ В УСЛОВИЯХ МОДЕЛИРОВАНИЯ ГЕМОРРАГИЧЕСКОГО ИНСУЛЬТА

Полный текст

Инсульт представляет собой актуальную медико-социальную проблему в связи с высоким уровнем заболеваемости (3,15 случаев на 1000 человек в год). В свою очередь, геморрагический инсульт (ГИ) составляет 20 % от общего числа инсультов и в 42 % случаев заканчивается летальным исходом [4]. Значимую роль в танатогенезе инсульта играет пневмония, ей обусловлено 21 % смертности при инсульте [9]. Одной из ведущих причин воспалительных осложнений признается иммунодефицит [14]. Анализируя последние данные научной литературы, можно заключить, что в условиях инсульта взаимовлияние нервной и иммунной систем имеет неоднозначный характер: постинсультный иммунодефицит предрасполагает пациентов к угрожающим жизни инфекционно-воспалительным осложнениям заболевания, но, вместе с тем, защищает мозг посредством ограничения аутоиммунной агрессии против клеток головного мозга, развивающейся в условиях формирования патологического очага и способствующей еще большему повреждению мозга [13, 14]. В связи с этим выявление особенностей реакции лимфоидных органов и, в частности, лимфоидных образований трахеи, а также оценка неврологического статуса в условиях моделирования ГИ помогут выявить закономерности процесса, возможные точки приложения терапевтических вмешательств с целью коррекции иммунного и неврологического статуса пациентов. Ввиду того, что у животных с различной устойчивостью к стрессу функциональные системы гомеостатического уровня реагируют на экспериментальные воздействия неодинаково [11], а также учитывая различия количественных показателей клеточного состава лимфоидных узелков трахеи у особей с высокой и низкой устойчивостью к стрессу в норме [5], была поставлена цель - изучить особенности клеточного состава лимфоидных узелков трахеи и оценить неврологический статус у крыс с различной устойчивостью к эмоциональному стрессу в условиях моделирования ГИ. Материал и методы. При работе с животными руководствовались «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденными на заседании этической комиссии НИИ нормальной физиологии им. П. К. Анохина РАМН (протокол № 1, от 03.09.2005 г.), требованиями Всемирного общества защиты животных (WSPA) и Европейской конвенции по защите экспериментальных животных. Документация по исследованию рассмотрена на заседании локального комитета по этике (протокол № 02-17 от 15.03.2017 г.). Материалом для изучения служила трахея 42 крыс-самцов линии Wistar (масса 250-300 г, возраст 4-6 мес). За 3 сут до моделирования инсульта для оценки устойчивости животного к стрессу проводили предварительное тестирование по тесту «открытое поле» в течение 3 мин и определяли индекс активности (ИА) крыс. В ранних исследованиях показано, что надежным прогностическим критерием устойчивости крыс к стрессорным нагрузкам является характер их поведения по тесту «открытое поле»: поведенчески активные животные оказались более устойчивыми к стрессорным воздействиям по сравнению с пассивными особями [6]. Для расчета ИА крысы сумму числа пересеченных секторов, числа вертикальных стоек и исследованных объектов делили на сумму латентных периодов первого движения и выхода в центр «открытого поля». Для эксперимента отбирали устойчивых (n=21, ИА 2,25-5,8) и неустойчивых к стрессу особей (n=21, ИА 0,25-0,79), амбивалентных животных из эксперимента исключали. Активных и пассивных крыс разделили на группы: интактная (норма), контрольная (ложная операция) и экспериментальная (геморрагический инсульт) - по 7 особей в каждой группе. Спустя 3 сут после тестирования на крысах экспериментальной группы был смоделирован геморрагический инсульт. Наркотизированным животным (внутрибрюшинно раствор хлоралгидрата, 4 мг/100 г массы тела) через отверстие в черепе диаметром 0,5 мм с помощью иглы с закругленным концом (№ 22) вводили аутокровь без добавления гепарина в объеме 60 мкл (стереотаксические координаты для введения иглы: A - 0,7 мм, L - 3 мм, H - 6 мм - область левого хвостатого ядра). Через 5 мин после введения аутокрови канюлю медленно извлекали, отверстие в черепе заделывали стоматологическим цементом, рану на голове крысы ушивали. В качестве контроля использовали крыс, которым были проведены те же манипуляции (наркотизация, трепанация, введение иглы в головной мозг), но без введения крови через иглу. Неврологический статус крыс оценивали по шкале Menzies к концу 1-х суток после операции [15]. Шкала включала: отсутствие неврологических симптомов (0 баллов); тоническая флексия передней противоположной стороне инсульта лапы при подъеме за хвост (1 балл); меньшее сопротивление пассивному движению, оказываемое противоположной передней лапой при потягивании за хвост (2 балла); движение в противоположную очагу сторону при удержании крысы за хвост (3 балла); спонтанное вращение крысы на горизонтальной поверхности в противоположную сторону (4 балла). Крыс выводили из эксперимента методом декапитации. Затем животных вскрывали, трахею препарировали целиком, выделяли зону вблизи бифуркации органа. Материал фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина. Парафиновые срезы толщиной 4-5 мкм окрашивали азуром II - эозином, гематоксилином-эозином, по Маллори. Подсчет клеток лимфоидного ряда проводили на стандартной площади гистологического среза (880 мкм²) в 10 полях зрения. Результаты подсчета обрабатывали статистически (SPSS17). Различия считали значимыми при p≤0,05 (по U-критерию Манна-Уитни). Результаты исследования. Клеточный состав лимфоидных узелков стенки трахеи заметно изменяется в условиях моделирования ГИ, причем неодинаково у крыс с различной устойчивостью к эмоциональному стрессу. У устойчивых крыс плотность распределения клеток в узелках значимо увеличивается по сравнению с контролем (в центральной части узелков - в 1,32 раза), что связано с увеличением числа малых лимфоцитов (табл. 1). Количество бластов и больших лимфоцитов в центре узелков увеличивается в 2 и 1,4 раза соответственно. Число плазмоцитов уменьшается (на верхушке узелков - в 2,66 раза, см. табл. 1). При этом в узелках увеличивается содержание деструктивно-измененных клеток (в центральной части - в 1,86 раза, см. табл. 1). У неустойчивых к стрессу крыс на 1-е сутки после моделирования инсульта плотность распределения клеток уменьшается в основании узелков (в 1,21 раза) и увеличивается в центральной части (в 1,28 раза) (табл. 2). Содержание малодифференцированных лимфоцитов возрастает, особенно в основании узелков, где появляются бласты, а число больших лимфоцитов повышается в 3,8 раза (см. табл. 2). Содержание плазматических клеток в узелках, напротив, резко уменьшается (особенно в центре - в 9 раз, p=0,080 и p1=0,049). Число деструктивно-измененных клеток в узелках увеличивается (особенно в центральной части - в 2,79 раза, причем более активно по сравнению с активными крысами (см. табл. 1, 2). Моделирование геморрагического инсульта приводило к значимым изменениям неврологического статуса крыс. В экспериментальных группах животных выявлялись фокальные неврологические симптомы. При оценке по шкале Menzies у устойчивых к стрессу крыс неврологический статус оценивался в 1,3±0,1 балла, а у неустойчивых - в 1,8±0,2 балла (p≤0,05). В норме и у крыс, подвергнутых ложной операции, фокальные неврологические симптомы отсутствовали. Обсуждение полученных данных. Результаты исследования позволили выявить связь устойчивости к эмоциональному стрессу со степенью иммунной защиты стенки трахеи и тяжестью неврологических расстройств, определяющими вероятность осложнений и исход ГИ. В 1-е сутки после моделирования ГИ лимфоидные узелки стенки трахеи у крыс реагируют активной деструкцией клеток лимфоидного ряда, которую можно связать с нарушениями гемомикроциркуляции и лимфооттока в стенке органа [2]. При этом содержание деструктивно-измененных клеток в узелках более значительно увеличивается у неустойчивых к стрессу особей (в центре узелков - в 2,8 раза). Деструкция клеток лимфоидного ряда в условиях моделирования внутримозгового кровоизлияния отмечалась и в тимусе [10]. Высокая активность деструкции клеток лимфоидного ряда у крыс с низкой устойчивостью к эмоциональному стрессу может объясняться выраженностью сосудистых и нейрональных изменений в головном мозгу у этой группы животных в аналогичных экспериментальных условиях [7]. Наряду с активной деструкцией клеток, в лимфоидных узелках трахеи у неустойчивых к стрессу крыс увеличивается содержание бластов и больших лимфоцитов. Поскольку только зрелые Т-иВ-лимфоциты могут мигрировать через посткапиллярные венулы [1], появление здесь малодифференцированных клеток, по-видимому, происходит в результате бласттрансформации зрелых форм лимфоцитов. При этом не отмечается формирования центров размножения, которые, как правило, выявляются в лимфоидных узелках полых трубчатых органов лишь в условиях высокой антигенной нагрузки на слизистую оболочку [8]. Вместе с тем, у неустойчивых к стрессу особей в условиях ГИ выявляется обеднение оснований лимфоидных узелков трахеи основными иммунокомпетентными клетками - малыми и средними лимфоцитами. Причиной тому может служить ослабление миграции клеток лимфоидного ряда из венул с высоким эндотелием в основание узелков, которое можно связать с накоплением избытков интерстициальной жидкости в стенке органа [2]. Другим фактором обеднения оснований узелков может являться перераспределение клеток лимфоидного ряда в связи с их активной миграцией в просвет органа. Это подтверждается увеличением числа малых лимфоцитов между клетками эпителиальной выстилки трахеи в условиях моделирования ГИ в 1,8 раза [2]. У устойчивых к стрессу крыс клеточный состав лимфоидных узелков характеризуется не только увеличением числа малодифференцированных клеток, но и накоплением малых и средних лимфоцитов в отличие от предрасположенных к стрессовому воздействию особей. Сходным образом на моделирование внутримозгового кровоизлияния реагируют лимфоидные узелки печеночных лимфатических узлов устойчивых к стрессу крыс [3]. В соответствии с результатами тестирования неврологический дефицит в 1-е сутки после моделирования инсульта более выражен у крыс с низкой устойчивостью к эмоциональному стрессу. Отмечено, что агрессивность и неустойчивость к стрессу связаны с повышенной продукцией провоспалительных цитокинов [12], что является негативным прогностическим фактором при инсульте. По-видимому, низкая стрессоустойчивость предрасполагает к угнетению иммунной защиты стенки трахеи и более тяжелым неврологическим расстройствам, что может способствовать развитию осложнений и ухудшить прогноз пациентов с ГИ. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: Л. А. К., Е. В. К. Сбор и обработка материала: Л. А. К. Статистическая обработка данных: Л. А. К., В. Г. М. Анализ и интерпретация данных: Л. А. К., С. В. К. Написание и редактирование текста: Л. А. К., А. А. Б. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

Об авторах

Людмила Анатольевна Клюева

Первый Московский государственный медицинский университет им. И. М. Сеченова

Email: moloko1978@gmail.com
Кафедра анатомии человека

Елена Владимировна Коплик

Научно-исследовательский институт нормальной физиологии им. П. К. Анохина

Email: e.koplik@mail.ru
лаборатория системных механизмов эмоционального стресса 125315, Москва, ул. Балтийская, 8

Владимир Григорьевич Моталов

Первый Московский государственный медицинский университет им. И. М. Сеченова

Кафедра анатомии человека

Анастасия Анатольевна Бахмет

Первый Московский государственный медицинский университет им. И. М. Сеченова

Email: anastasbakhmet@mail.ru
Кафедра анатомии человека

Светлана Валерьевна Клочкова

Первый Московский государственный медицинский университет им. И. М. Сеченова; Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова

Email: swetlana.chava@yandex.ru
Кафедра анатомии человека; кафедра нормальной и топографической анатомии; факультет фундаментальной медицины

Список литературы

Дополнительные файлы