PERIPHERAL BLOOD NEUTROPHIL MORPHOLOGY IN THE AMERICAN MINK (NEOVISON VISON) OF VARIOUS COLORS: A MORPHOMETRIC STUDY

全文:

К настоящему времени у американской норки (Neovison vison) в ходе исторической доместикации зарегистрировано 35 мутаций, затрагивающих окраску волосяного покрова, на основе которых сформировано свыше 150 комбинативных цветных форм [2, 3]. Изучение феногенетики мутаций показало, что они обладают широким спектром плейотропного действия. В частности, через морфофункциональную организацию лейкоцитов они могут влиять на клеточный иммунитет, снижая резистентность к вирусным и бактериальным возбудителям заболеваний. В спектре мутаций американской норки специального внимания заслуживает алеутский ген (a/a), который вызывает симптомы, сходные с редким наследственным заболеванием человека - синдромом Чедиака-Хигаши (СЧХ). Подобный генетический дефект наблюдается и у некоторых других видов животных - крыс, мышей, кошек, касаток, норок, лисиц, песцов и крупного рогатого скота [7, 10]. Характерной особенностью СЧХ является присутствие в лейкоцитах и других типах клеток аномально больших гранул. Кроме нарушения в лейкоцитах, обнаружено ослабление пигментации кожи, волос и глаз [6, 12]. Есть основания полагать, что целлюлярный дефект при СЧХ связан с мутацией гена LYST (lysosomal trafficking regulator), ответственного за регуляцию транспорта лизосом, а также подобных им органелл, в том числе меланосом [7, 11]. У человека аномалия лейкоцитов приводит к летальному исходу в детском возрасте от инфекций или геморрагий, часто предшествующих развитию лимфомоподобной фазы болезни. Лишь незначительное число пациентов доживают до взрослого состояния. У них признаки СЧХ ассоциированы с фатальной неврологической дисфункцией [8, 13]. У норок - носителей алеутского гена (a/a) - наблюдаются низкая жизнеспособность, повышенная эмбриональная и ранняя постнатальная смертность, а также снижение устойчивости к вирусному плазмоцитозу [2, 3]. В медико-биологических исследованиях в качестве модельного объекта СЧХ чаще всего используются линии лабораторных мышей, несущие гены, замаркированные бежевой окраской (beige); очень редко - монорецессивные алеутские норки, волосяной покров которых под влиянием мутации приобрел цвет вороненой стали [7]. По интенсивности патологических изменений в организме они занимают промежуточное положение между пациентами с СЧХ и бежевыми мышами. У алеутских норок так же, как и у пациентов с СЧХ, значительное отклонение от нормы обнаружено в нейтрофилах и менее выраженное (подобно мышам beige) в эозинофилах [14]. Цель работы состояла в изучении особенностей структуры нейтрофилов периферической крови у американской норки (Neovison vison) различных окрасов. Материал и методы. Исследование проведено в световом микроскопе на мазках периферической крови от 92 особей американской норки 6-месчного возраста, разводимых на экспериментальной звероферме Института цитологии и генетики СО РАН (14 генотипов) и в звероводческих хозяйствах Республики Карелия (4 генотипа). Исследовались норки темно-коричневого окраса, близкого к дикому типу. Кроме того, объектом исследования послужили монорецессивные норки [окрасы - серебристо-голубая (p/p), пастель (b/b), белая хедлюнд (h/h), алеутская (a/a); дирецессивные норки: окрасы - жемчуг двойной (k/k p/p), финский топаз (tS/tS b/b), сапфировая (a/a p/p), лавандовая (m/m a/a); трирецессивные норки: окрас - виолет (m/m a/a p/p); полудоминантные норки: окрасы - Леопард стандартный (SK/+), Королевская серебристая (SR/+), Черный хрусталь (CR/+); доминантно-рецессивные норки: окрасы - Куйтежская пестрая (SK/+b/b), Снежный топаз (CR/+tS/tS b/b), Шедоу сапфир (SH/ a/a p/p), Леопард сапфировый (SK/+a/a p/p), Крестовка сапфир (S/+a/a p/p)]. Периферическую кровь у норок получали из хвостовой вены. Мазки окрашивали по Паппенгейму, используя краситель-фиксатор Мая - Грюнвальда и краситель Романовского (MiniMed, Россия). На мазках выявляли нейтрофилы с аномально большими гранулами. Морфометрию гранул (число гранул на 1 сегментоядерный нейтрофил и площадь гранул) проводили с помощью методики NCR (nuclear cell relation), входящей в пакет компьютерной системы анализа изображений «Видеотест» (Россия). В целом параметры установлены для 1299 гранул. Микрофотографии лейкоцитов получены в световом микроскопе Axioscop 40 (Carl Zeiss) с цветной цифровой видеокамерой (Pixera 150ES). Обработку цифрового материала проводили общепринятыми методами вариационной статистики с применением непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни. Работа выполнена с соблюдением международных принципов Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным [9] и «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» [5]. Эксперименты одобрены независимым комитетом по биоэтике ИБ КарНЦ РАН, протокол от 03.10.2011 г. Результаты исследования. Исследованиями выявлено, что в зависимости от структуры лейкоцитов периферической крови окрасы норок можно разделить на две группы (таблица). В одну группу входят норки, в генотипе которых отсутствует алеутский ген (a/a): темно-коричневая, а также серебристо-голубая, пастель, белая хедлюнд, жемчуг двойной, финский топаз, Леопард стандартный, Королевская серебристая, Черный хрусталь, Куйтежская пестрая и Снежный топаз. В нейтрофилах у норок этих окрасов в световом микроскопе как у человека и других видов млекопитающих видна едва видимая мелкая зернистость. Другую группу составляют норки, в генотипе которых в гомозиготном состоянии содержится алеутский ген (a/a) - алеутская, сапфировая, лавандовая виолет, Шедоу сапфир, Леопард сапфировый и Крестовка сапфир. В лейкоцитах этой группы норок (в части нейтрофилов, во всех эозинофилах и базофилах, а также в единичных лимфоцитах) в цитоплазме обнаружены «гигантские» гранулы. Аномальные лейкоциты периферической крови норок различных генотипов, созданных на основе алеутской мутации, представлены на рис. 1. В нейтрофилах, лимфоцитах и эозинофилах при окраске по Паппенгейму наблюдались гранулы розового цвета, в базофилах - темно-фиолетового. Гранулы нейтрофилов (см. рис. 1, а-в), лимфоцитов и базофилов (см. рис. 1, ж-м) округлой формы и представлены гомогенным материалом. В эозинофилах, в отличие от перечисленных типов лейкоцитов, аномальные гранулы вариабельны по форме и величине, довольно часто сложной конфигурации, в некоторых из них видны признаки их слияния в единую структуру (см. рис. 1, г-е). У алеутских и комбинативных форм норок, у которых в генотипе присутствует алеутский ген (a/a), в нейтрофилах имеются одна или несколько аномальных гранул. Морфометрический анализ показал, что генотипы различаются между собой по степени дефекта, т.е. по числу и размеру гранул. Причем более значительно различия выражены в размере, чем в числе гранул (рис. 2). Наименьшее число гранул выявлено в лейкоцитах у окраса Крестовка сапфир - в среднем 2,65±0,42 на один сегментоядерный нейтрофил, наибольшее у виолет - 4,27±0,53. Изменение площади одной гранулы имеет обратный характер, которая увеличивается от 0,31±0,02 мкм2 у норок виолет до 0,52±0,06 мкм2 у Крестовки сапфир. Наибольшее число значимых различий обнаружено между норками виолет и мутантными окрасами из серии «крестовка» - Шедоу сапфир, Леопард сапфировый и Крестовка сапфир. Обсуждение полученных данных. Наличие в генотипе норок в гомозиготном состоянии гена алеутской окраски (a/a) вносит изменение в структуру лейкоцитов периферической крови. Особенностью лейкоцитов у этих норок является присутствие аномальных «гигантских» гранул. В нейтрофилах их количество меньше, чем в эозинофилах, и колеблется в небольших пределах - от одной до нескольких гранул на лейкоцит. Формирование в нейтрофилах у норок аномальных гранул может быть причиной функциональной недостаточности фагоцитов, а в лимфоцитах рассматриваться как дефект естественных киллеров [10]. Судя по морфологическим наблюдениям, под воздействием алеутского гена (a/a) цитоплазматические гранулы в лейкоцитах увеличиваются. Цитохимическими методами показано, что по распределению лизосомальных ферментов (альфа-нафтилацетатэстераза, нафтол-AS-D-хлорацетатэстераза) и пероксидазы дефектные структуры в нейтрофилах соответствуют азурофильным, или так называемым первичным гранулам [1, 4]. Популяция вторичных или специфических гранул, образующихся после первичных, не изменяется [14]. Как происходит образование «гигантских» гранул хорошо видно в лейкоцитах в костном мозге. Согласно полученным нами результатам [1] и данным литературы, в нейтрофилах в костном мозгу признаки значительного увеличения размеров гранул обнаружены на более ранних стадиях созревания, чем в эозинофилах, что свидетельствует об особенностях гранулогенеза этих типов лейкоцитов. Аномальные структуры в нейтрофильных миелоцитах состоят из светлого матрикса и мелких гранул краснокирпичного цвета. В зрелых нейтрофилах периферической крови они представлены гомогенным материалом, который окрашивается менее интенсивно. На выраженность дефекта лейкоцитов, обусловленного алеутской мутацией, может повлиять присутствие и взаимодействие генов, контролирующих пигментацию волосяного покрова. Анализ сходства между различными генотипами норок, содержащими сублетальный аллель a/a, рассчитанного сразу по нескольким показателям (состав лейкоцитарной формулы, количество аномальных гранул в нейтрофилах и эозинофилах), выявил их зависимость от генетического окружения [4]. В настоящей работе, исходя из результатов морфометрического определения параметров (число и площадь) только нейтрофильных аномальных гранул, также установлено, что деструктивный эффект модифицируется генами, затрагивающими пигментацию. Из исследуемого нами набора генетических сочетаний выделяются норки виолет, имеющие в генотипе гены мойл, алеутского и серебристо-голубого окрасов. В нейтрофилах у норок виолет генерируется особенно большее количество относительно мелких гранул. К этому окрасу по количеству гранул в нейтрофилах приближаются лавандовые норки (см. рис. 2). Таким образом, в настоящей работе показано, что изменению функций меланосом у норок, гомозиготных по алеутскому гену (a/a), сопутствует нарушение гранулогенеза в лейкоцитах, приводящее к образованию «гигантских» гранул. Наибольшее действие алеутского гена (a/a) проявляется в его комбинации с генами серебристо-голубой окраски (p/p) и мойл (m/m) при образовании трирецессивной формы норок виолет (m/m a/a p/p), в нейтрофилах которых наблюдается максимальное количество аномальных гранул, меньших, чем у других генотипов размеров. Работа выполнена с использованием научного оборудования Центра коллективного пользования ИБ КарНЦ РАН и коллекции генотипов норок Центра коллективного пользования «Генофонды пушных и сельскохозяйственных животных» Института цитологии и генетики СО РАН. Финансовое обеспечение исследований осуществлялось из средств федерального бюджета на выполнение государственного задания (№ тем: 0221-2014-0031 и 0324-20150004). Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: Л. Б. У., А. Г. К., О. В. Т., Н. Н. Т. Сбор и обработка материала: Л. Б. У., А. Г. К., О. В. Т., Л. И. Т. Статистическая обработка данных: А. Г. К., В. А. И. Анализ и интерпретация данных: Л. Б. У., А. Г. К., В. А. И., О. В. Т. Написание текста: Л. Б. У., А. Г. К. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

作者简介

L. Uzenbayeva

RAS Karelian Research Center Institute of Biology

Email: uzenb@bio.krc.karelia.ru
Laboratory of Ecological Physiology of Animals 11 Pushkinskaya Str., Petrozavodsk 185910

A. Kizhina

RAS Karelian Research Center Institute of Biology

Laboratory of Ecological Physiology of Animals 11 Pushkinskaya Str., Petrozavodsk 185910

L. Trapezova

RAS Siberian Branch Institute of Cytology and Genetics

Laboratory of Genetics and Selection of Fur and Farm Animals 10 Prospekt Lavrentiyeva, Novosibirsk 630090

V. Ilyukha

RAS Karelian Research Center Institute of Biology

Laboratory of Ecological Physiology of Animals 11 Pushkinskaya Str., Petrozavodsk 185910

N. Tyutyunnik

RAS Karelian Research Center Institute of Biology

Laboratory of Ecological Physiology of Animals 11 Pushkinskaya Str., Petrozavodsk 185910

O. Trapezov

RAS Siberian Branch Institute of Cytology and Genetics

Email: otrapezov@academ.org
Laboratory of Genetics and Selection of Fur and Farm Animals 10 Prospekt Lavrentiyeva, Novosibirsk 630090

参考

补充文件