STRUCTURAL AND HISTOCHEMICAL CHANGES IN THE RAT CEREBELLUM PURKINJE CELLS AFTER CHOLESTASIS

全文:

В последние десятилетия неуклонно растет число заболеваний желчевыделительной системы. Существенный вклад в эту патологию вносит желчнокаменная болезнь: от 10 до 15% людей в промышленно развитых странах, 20% европейцев и около 50% американских индейцев страдают этим заболеванием [8, 9]. Нарушение оттока желчи приводит к её застою в желчевыводящих путях (холестазу), прекращению её поступления в двенадцатиперстную кишку и накоплению компонентов желчи в крови. При этом происходит нарушение пищеварения и всасывания пищи в кишечнике (особенно жиров), уменьшается масса тела и усвоение жирорастворимых витаминов А, D, Е, К, а также кальция; в органах нарушаются процессы перекисного окисления липидов, изменяется текучесть мембран и активность Na+/K+-АТФазы [6]. В условиях холестаза отмечаются функциональные и морфологические изменения во многих органах и системах организма, включая ЦНС [5, 11, 13]. Однако в литературе отсутствуют систематические и детальные морфологические работы по изучению структур мозга и, в частности мозжечка, в динамике подпеченочного холестаза. Поэтому целью настоящего исследования явилось установление структурных и гистохимических изменений в клетках Пуркинье (КП) мозжечка крыс в динамике полного подпеченочного холестаза. Материал и методы. В работе использован материал от 92 беспородных белых крыс-самцов массой 200±25 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария. Все опыты проведены с учётом «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приложение к приказу № 755 от 12.08.1977 г. МЗ СССР). На проведение данных исследований получено разрешение этического комитета Гродненского государственного медицинского университета. Подопытным крысам под эфирным наркозом перевязывали общий жёлчный проток на 3–5 мм ниже слияния долевых протоков двумя лигатурами с последующим пересечением между ними. Животным контрольной группы проводили ложную операцию. Через 2, 5, 10, 20, 45 и 90 сут в утренние часы (для синхронизации по времени) животных контрольной и подопытной групп декапитировали (на каждую временную точку приходилось не менее 4 особей). Извлекали головной мозг, и кусочки мозжечка фиксировали в жидкости Карнуа (для заливки в парафин), замораживали и хранили в жидком азоте (для дальнейшего гистоэнзиматического исследования) или фиксировали в 1% растворе OsO4 (для электронно-микроскопического исследования). Парафиновые срезы толщиной 5–10 мкм окрашивали гематоксилином—эозином, толуидиновым синим по методу Ниссля; по I. V. Victorov и соавт. [14] для выявления погибших нейронов и РНК — по Эйнарсону [4]. Криостатные срезы мозжечка толщиной 10 мкм (криостат Leica CM 1840, Германия) обрабатывали общепринятыми гистохимическими методами для выявления активности ферментов: связанных с циклом Кребса — сукцинатдегидрогеназы (СДГ; КФ 1.3.99.1); с пентозофосфатным путем — глюкозо-6фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ; КФ 1.1.1.49); с транспортом электронов — NADH-дегидрогеназы (NADH-ДГ; КФ 1.6.99.3); с гликолизом — лактатдегидрогеназы (ЛДГ; КФ 1.1.1.27). Для выявления кислой фосфатазы — маркерного фермента лизосом (КФ; КФ 3.1.3.2) срезы предварительно фиксировали в 10% нейтральном формалине и обрабатывали по методу Гомори [4]. Для электронно-микроскопического исследования срезы изготавливали на ультрамикротоме МТ-7000 (RMC, США), контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца, изучали и фотографировали при помощи электронного микроскопа JEM 100CX II (Jeol, Япония) в Центре электронной микроскопии Института физиологии НАН Беларуси. При помощи микроскопа «Axioscop» с цифровой видеокамерой «AxioCam MRc5» (Carl Zeiss, Германия) проводили визуальную оценку и микрофотографирование гистологических препаратов. В препаратах, окрашенных по методу Ниссля, на отрезках извилин коры мозжечка длиной 250 мкм подсчитывали число неизмененных и патологических форм КП (общее количество нейронов, среди них: нормохромных, гипохромных, гиперхромных не сморщенных, гиперхромных сморщенных, клеток-теней; а также — количество глиоцитов). На препаратах, окрашенных по методу I. V. Victorov и соавт. [14], подсчитывали количество погибших нейронов. Морфометрию и цитофотометрию проводили с помощью программы компьютерного анализа изображения Image Warp (Bit Flow, США). На препаратах, окрашенных по методу Ниссля, измеряли минимальный и максимальный радиус перикариона, периметр, площадь сечения, объем, определяли факторы и формы элонгации КП. Активность ферментов и содержание РНК оценивали цитофотометрически по оптической плотности осадка продуктов реакции с помощью системы компьютерного анализа изображения, состоящей из компьютера с программой анализа изображения («Bioscan NT» 2.0, Kanaco Ltd, Беларусь), микроскопа и видеокамеры, в единицах оптической плотности, умноженной на 1000 (ед.). Измерения оптической плотности цитоплазмы нейронов проводили в максимуме поглощения окрашенного продукта реакции. В каждой группе оценивали 150–250 нейронов. Электронную морфометрию проводили по методике И. Я. Морозова [3]. Полученные результаты обрабатывали методами непараметрической статистики с помощью лицензионной компьютерной программы Statistica 5.5 для Windows. В описательной статистике для каждого показателя определяли значение медианы (Me) и интерквартильного диапазона (IQR). Различия между показателями в контрольной и подопытной группах считали значимыми при P<0,05 по U-критерию Вилкоксона—Манна—Уитни. Результаты исследования. Полный подпечёночный холестаз от 5 до 40 сут приводит к гибели 67% животных. Холестаз в течение 2 и 5 сут не вызывает видимых структурных изменений в мозжечке на светооптическом уровне. На 10-е сутки в КП определяются значительные структурные нарушения: деформация и увеличение ядер, эксцентричное расположение ядрышек. Апикальные отростки нейронов расширяются. В цитоплазме одних нейронов наблюдается хроматолиз, что приводит к появлению гипохромных участков, других — гиперхроматоз. Встречаются одиночные и небольшие группы (очаги) сморщенных КП. При подсчете различных морфологических форм нейронов выявлено, что 10-суточный холестаз приводит к уменьшению числа нормохромных КП в 3 раза, число гиперхромных не сморщенных нейронов увеличивается в 3,8 раза. В значительном количестве появляются гиперхромные сморщенные, гипохромные нейроны и клетки-тени, которые в контроле не встречаются. Количество погибших нейронов, выявляемых по методу Викторова, возрастает в 9,6 раза, однако общее количество нейронов, выявляемых по Нисслю, существенно не меняется. При подсчете общего числа КП через 90 сут от начала опыта обнаружено уменьшение их числа на 14%. При морфометрическом исследовании изменения размеров и формы перикарионов КП выявляются уже на 2-е сутки холестаза, к 5-м суткам они усиливаются, а на 10-е сутки — достигают максимума. Так, уменьшаются: большой радиус перикарионов — на 8,6%, малый — на 11,0%, периметр — на 9,7%, фактор формы — на 5,7%, площадь сечения — на 17,0% и объем — на 18,2%; при этом фактор элонгации возрастает на 3,9%. Это свидетельствует о некотором сморщивании и вытягивании нейронов. Ядра КП в целом претерпевают аналогичные изменения. В дальнейшем (45-е сутки) происходит нормализация изученных показателей, ик 90-м суткам статистически значимых изменений не обнаруживается. Холестаз приводит к постепенному снижению в цитоплазме КП активности СДГ, NADH-ДГ, Г-6-ФДГ и содержания РНК, но возрастанию активности ЛДГ и КФ. Эти изменения достигают максимума на 10-еи 20-е сутки холестаза, а затем (на 45–90-е сутки опыта) у выживших животных постепенно исчезают (рис. 1). Электронно-микроскопическое исследование КП на 10-е сутки холестаза выявило разнообразные деструктивные изменения. Ядра нейронов несколько вытянуты, ядерная оболочка имеет сильно извитой ход и образует многочисленные складки, местами она нечеткая, размыта. В этих участках наблюдается массовый выход субъединиц рибосом в цитоплазму. Размер ядрышка часто увеличен и расположение гранул в нем — компактное. Митохондрии набухшие, кристы частично или полностью разрушены, иногда встречаются гигантские митохондрии. Комплекс Гольджи гипертрофирован, его цистерны значительно увеличены, иногда образуют кольцевидные структуры (рис. 2). Выявляются многочисленные лизосомы, а также фаголизосомы, мультивезикулярные тельца. Гранулярная эндоплазматическая сеть теряет рибосомы, при этом возрастает количество свободных рибосом и полисом. Иногда встречаются сморщенные КП с сильно вытянутым ядром, в котором преобладает гетерохроматин. Результаты морфометрии показали, что через 10 сут холестаза происходит уменьшение средней площади сечения КП на 23%, площади поверхности мембран гранулярной эндоплазматической сети — на 36%, ширина её цистерн увеличивается на 29%. Общее число рибосом уменьшается на 42%, из них количество связанных — снижается в 3,5 раза, а свободных — увеличивается на 33%. Площадь поверхности мембран гладкой эндоплазматической сети уменьшается на 53%. Количество митохондрий уменьшается на 32%, их средняя площадь уменьшается на 44%, а степень набухания увеличивается на 29%, коэффициент фрагментации крист возрастает на 31%. Площадь поверхности мембран комплекса Гольджи возрастает в 2,3 раза, ширина его цистерн увеличивается на 60%. Количество лизосом возрастает в 2 раза, а их средняя площадь — в 3,8 раза (таблица). Обсуждение полученных данных. После перевязки общего жёлчного протока у крыс развиваются закономерные структурные и метаболические нарушения КП мозжечка. Эти изменения имеют динамический, волнообразный характер: они появляются на 2–5-е сутки холестаза, через 10–20 сут достигают максимума (тяжёлые изменения [1] и массовая гибель нейронов), через 45 сут у выживших животных они постепенно уменьшаются, а через 90 сут сохраняются лишь некоторые остаточные изменения. При этом размеры, форма нейронов и показатели их метаболизма полностью нормализуются. Такую динамику можно объяснить самопроизвольным разрешением холестаза в результате разрастания обходных желчевыводящих протоков и восстановления тока желчи в двенадцатиперстную кишку. Мы полагаем, что выживают только те экспериментальные животные, у которых успевает восстановиться отток желчи до развития полиорганной недостаточности и необратимых нарушений в организме. Изменения в нейронах мозжечка в отдалённые сроки после операции в настоящей работе описаны именно у них. При холестазе происходит изменение размеров и формы КП: их сморщивание (уменьшение площади сечения и объема), потеря сферичности и вытягивание, что возможно связано с повышением осмолярности межклеточной жидкости [10, 12]. Это сопровождается угнетением активности ключевых цитоплазматических ферментов: системы транспорта электронов (NADH-ДГ), пентозофосфатного пути (Г-6-ФДГ), митохондриальных энергетических процессов (СДГ), но при этом имеет место компенсаторная активация гликолиза (ЛДГ). Активность маркерного фермента лизосом — КФ — значительно возрастает. Уменьшается количество РНК в цитоплазме. Такие гистохимические изменения хорошо согласуются с установленными в этих нейронах ультраструктурными нарушениями: деструкцией митохондрий, гранулярной эндоплазматической сети, уменьшением числа связанных рибосом, увеличением числа и размеров лизосом. Увеличение числа лизосом и фагосом может отражать усиление аутофагии повреждённых мембран и органелл в КП в услових холестаза. Следует отметить некоторую особенность строения ядерной оболочки КП мозжечка: нами не обнаружено увеличение числа и размеров ядерных пор, но в определенных местах ядерная оболочка имеет размытый вид или не определяется вовсе. Именно в таких участках видны скопления субъединения рибосом и их выход за пределы ядра, а также прилежащие гипертрофированные митохондрии. Усиленный выход субъединиц рибосом, как и увеличение числа свободных полирибосом в цитоплазме, свидетельствуют об усилении белкового синтеза для собственных нужд клеток и адаптационных процессов в нейронах на субклеточном уровне, что согласуется с мнением других исследователей [1]. Гипертрофия комплекса Гольджи, нарастание числа лизосом и фаголизосом в сочетании с увеличением числа свободных рибосом указывает на синхронизацию процессов повреждения и восстановления в КП. Подобные изменения в нейронах наблюдали и при других экспериментальных воздействиях [1, 2]. Таким образом, КП мозжечка очень чувствительны к холестазу, но имеют высокую пластичность. При этом процессы повреждения и восстановления идут параллельно. В целом, выявленные изменения в нейронах неспецифичны и отличаются от реактивных изменений при других патологических воздействиях только скоростью появления, степенью выраженности и последовательностью наблюдаемых структурных и метаболических изменений.

作者简介

S. Yemelyanchik

Yanko Kupala Grodno State University

S. Zimatkin

Grodno State Medical University

Email: zimatkin@grsmu.by

参考

补充文件