CHANGES OF THE STRUCTURAL ORGANIZATION OF THE NUCLEUS RAPHE PALLIDUS AFTER THE DECREASE OF ENDOGENOUS SEROTONIN LEVEL IN THE PRENATAL PERIOD OF DEVELOPMENT IN RATS

全文:

Одним из серотонинергических ядер шва, расположенных в каудальной зоне серотонинергической системы продолговатого мозга млекопитающих, является бледное ядро. Функциональная значимость последнего определяется множеством проекций его нейронов на многочисленные медуллярные центры, контролирующие вегетативную, дыхательную, сердечно-сосудистую системы [2, 6]. Недавние физиологические исследования показали, что бледное ядро шва осуществляет регуляцию деятельности респираторных пейсмекерных нейронов комплекса пре-Бетцингера, участвуя, таким образом, в ритмогенезе дыхательных циклов [4]. Более того, нейроны этого ядра, проецируясь на моторные нейроны спинного мозга, иннервирующие диафрагмальную мускулатуру, регулируют их активность, а следовательно, степень расширения верхних воздухоносных путей и расслабление дыхательной мускулатуры, что особенно важно в период раннего развития новорожденных [4, 8]. Несмотря на роль этого серотонинергического ядра, до сих пор практически неизвестны особенности его структурной организации, а также зависимость процессов формирования ядра от содержания эндогенного серотонина в период пренатального развития. Цель настоящей работы — изучение роли серотонина в развитии бледного ядра шва, динамики и характера изменений его структуры в разные сроки начального постнатального периода у крыс, развивавшихся в нормальных условиях и при дефиците серотонина. Материал и методы. Работа выполнена на лабораторных крысах линии Вистар в соответствии с «Правилами работ с использованием экспериментальных животных» (приложение к приказу № 755 от 12.08.1977 г. МЗ СССР). Для снижения у крыс содержания эндогенного серотонина использовали метод ингибирования триптофангидроксилазы (фермента его синтеза) парахлорфенилаланином (пХФА) (Sigma, США), который вводили внутрибрюшинно в дозе 400 мг/кг. Показано, что в этой дозе как у взрослых животных, так и у развивающихся плодов пХФА вызывает длительное снижение содержания эндогенного серотонина (до 50–80%) [3, 5]. Самкам крыс (n=20) пХФА вводили на 16-е сутки беременности, в период формирования у плодов собственной серотонинергической системы [1]. Головной мозг крысят исследовали на 5-, 10-, 12-еи 14-е постнатальные сутки. В качестве контроля использовали животных соответствующих сроков развития, полученных от интактных самок, и самок, которым вводили изотонический раствор хлорида натрия на те же сутки беременности. На каждую временную точку использовано по 5–6 крысят как контрольных, так и подопытной групп. Материал фиксировали в цинк-этанолформальдегиде на фосфатно-солевом буфере (рН=7,4), заливали в парафин по общепринятой методике и готовили поперечные серийные срезы продолговатого мозга на уровне Bregma от –12,84 до –13,44 мм толщиной 4–5 мкм, часть из которых после депарафинирования окрашивали метиленовым синим по методу Ниссля. Иммуноцитохимическую реакцию с целью выявления серотонина осуществляли с использованием поликлональных кроличьих антител к серотонину (Novocastra, США), клон — NCL-SERT-p, разведение 1:200 и набора LSAB2+System-HRP (вторичные антитела и конъюгат стрептовидина с пероксидазой) (Dako, Дания). Для визуализации связанных первичных антител использовали хромоген DAB+ (Dako, Дания). После проведения иммуноцитохимической реакции часть срезов докрашивали гематоксилином Майера (БиоВитрум, Россия) и заключали в синтетическую среду Permaunt (Termo, США). Исследования проводили под световым микроскопом Leica DME (Leica, Германия). Изображения получали при помощи цифровой видеокамеры Leica EC3 (Leica, Германия). У 3–4 животных каждого срока исследования экспериментальной и контрольных групп на 10 изображениях поперечных серийных срезов продолговатого мозга, окрашенных по Нисслю, определяли среднюю площадь тел нейронов на срезах, где эти клетки содержали ядрышко. Кроме того, на этих же срезах подсчитывали количество отдельных популяций серотонинергических нейронов, различающихся по площади и форме тела. Статистическую обработку полученных морфометрических показателей осуществляли при помощи пакета прикладных компьютерных программ Statistica 6.0., ImageScope Color и ORIGIN50. Определяли среднее значение цифровых показателей и его стандартную ошибку. Значимость различий определяли по величине t-критерия Стьюдента. Различия считали значимыми при P<0,001. Результаты исследования. Как у контрольных, так и у подопытных животных на 5-е сутки жизни в бледном ядре шва присутствуют 2 популяции нейронов, из которых лишь одна серотонин-иммунопозитивна. Ее нейроны — более крупные (размером 103±7 мкм² и 99,5±8,7 мкм² соответственно), преимущественно мультиполярные, с центрально расположенным ядром и небольшим объемом цитоплазмы. Число нейронов такого типа составляет соответственно 11–13 и 7–10 клеток на срезе (здесь и далее об. 20, ок. 10). Нейроны второй популяции — более мелкие (45±4 мкм² в контроле и 25±5 мкм² у подопытных крыс), веретеновидные, серотониниммунонегативные, численностью 15–17 и 12–13 клеток на срезе соответственно. На 10-е сутки у контрольных и животных, развивавшихся при дефиците серотонина, в отличие от предыдущего срока исследования, в бледном ядре шва присутствуют 2 популяции серотониниммунопозитивных нейронов. Более крупные нейроны (111±8 мкм² и 102±6 мкм² соответственно), в основном, мультиполярны, их цитоплазма и отростки интенсивно серотонинпозитивны, число нейронов такого типа в контроле несколько возрастает до 15–16 клеток, а в опыте до 12–13 клеток на срезе. Популяция более мелких нейронов (51±31 мкм² и 26,8±2,2 мкм² соответственно), веретеновидной формы с небольшим объемом цитоплазмы, численностью 17–18 клеток на срезе у контрольных и 12 клеток у подопытных крысят. На 12-е сутки в бледном ядре шва у контрольных и подопытных животных также присутствуют 2 популяции серотонин-синтезирующих нейронов. Размер крупных нейронов у контрольных крыс увеличивается (133±12 мкм²), а их число практически не меняется и составляет 16–18 клеток на срезе. Нейроны, в основном, мультиполярны, хотя иногда встречаются и веретеновидной формы, их цитоплазма интенсивно окрашена, ядра располагаются в центральной части клетки (рисунок, а). Морфологические характеристики малых нейронов, их размер (49±4 мкм²) и численность, 15–18 клеток на срезе, практически не меняются по сравнению с таковыми в предыдущий срок исследования. На 12-е сутки у животных, развивавшихся на фоне дефицита серотонина, размер более крупных нейронов (94±12 мкм²) практически не меняется, однако их число сокращается и не превышает 7–8 клеток на срезе, они как мультиполярные, так и веретеновидной формы (см. рисунок, б). Морфометрические показатели малых нейронов, имеющих веретеновидную форму (малый объем цитоплазмы, слабо окрашенной при реакции на серотонин, их размер — 30,3±2,2 мкм², и численность — 10–12 клеток на срезе), также не изменяются и примерно соответствуют таковым в предыдущий срок исследования. На 14-е сутки как у контрольных, так и у подопытных животных нейроны обеих серотонинсинтезирующих популяций имеют морфологические и количественные характеристики, схожие с таковыми на 12-е сутки жизни. Однако в этот постнатальный срок у животных, испытавших дефицит серотонина в пренатальный период, появляются нейроны с признаками гиперхроматоза (см. рисунок, в) крупноячеистой вакуолизацией цитоплазмы и деформацией ядер, приводящими к дегенеративным процессам в бледном ядре шва. Обсуждение полученных данных. Результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что у крыс в бледном ядре шва присутствуют 2 популяции серотонинергических нейронов, различающихся своими морфологическими характеристиками. В ранние постнатальные сроки (5-е сутки) серотонин-синтезирующими являются только крупные нейроны, у малых нейронов синтетическая активность появляется позднее — к 10-м суткам. С возрастом — к 12-м суткам в норме размер крупных нейронов и их число увеличиваются, что может свидетельствовать о продолжающемся процессе дифференцировки и/или увеличении функциональной нагрузки. Размер и численность малых нейронов после 5-х суток с возрастом практически не изменяются. Дефицит серотонина во время пренатального развития приводит к нарушению структурной организации бледного ядра шва. У подопытных животных отмечено значительное уменьшение по сравнению с контролем размеров и численности серотонин-синтезирующих нейронов обеих популяций, при этом их размер с возрастом остается неизменным. С увеличением постнатального возраста нейроны чаще подвергаются дегенерации, что также способствует сокращению численности популяций серотонинергических нейронов. Такие повреждения, несомненно, будут изменять серотонинергическую иннервацию медуллярных ядер, в частности, комплекса пре-Бетцингера — генератора дыхательного ритма, регулирующего такие параметры, как частота, регулярность и амплитуда дыхания, а также оказывать влияние на проекционные связи с другими ядрами дыхательной системы [2, 4, 6, 7] и в результате приводить к тяжелым клиническим последствиям в виде нарушения дыхания.

作者简介

L. Khozhai

RAS I. P. Pavlov Institute of Physiology

Email: astarta0505@mail.ru

T. Shishko

RAS I. P. Pavlov Institute of Physiology

参考

补充文件