MORPHO-FUNCTIONAL CHARACTERISTICS OF CONDUCTING AIRWAYS AND THE RESPIRATORY PORTION OF RAT LUNG UNDER THE CONDITIONS OF INTRATRACHEAL INFECTION FROM THE POSITIONS OF THE NEUROENDOCRINE REGULATION OF REPARATIVE HISTOGENESES

全文:

Покровный эпителий воздухоносных путей является одним из важнейших барьеров, стоящих на пути микробной интервенции в организм, что обусловлено продукцией бактерицидного секрета, содержащего лизоцим, лактоферрин и другие факторы защиты [15, 16]. До сих пор малоизученными остаются вопросы взаимодействия микроорганизмов, обладающих соответствующим персистентным потенциалом (антилизоцимной, антиинтерфероновой, антилактоферриновой активностями), и тканевых структур лёгких, а также влияния прокариот на репаративные процессы в различных отделах органа [3–6]. Общеизвестно, что гипоталамо-гипофизарный нейроэндокринный комплекс у позвоночных животных играет ведущую роль в интеграции систем организма, поддержании гомеостаза, а также в реализации адаптивных функций [2, 8, 9]. Данный эффект реализуется в условиях различных неблагоприятных воздействий на организм, в том числе и при инфицировании [9, 10]. Однако в силу неоднородности популяции прокариот важно изучить отличительные черты реактивных изменений в гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системе (ГГНС) в зависимости от персистентных характеристик бактерий. Цель настоящего исследования — проведение морфофункциональной оценки воздухоносных и респираторных отделов лёгких крыс в условиях интратрахеального введения штаммов Staphylococcus aureus, обладавших антилактоферриновой активностью (АЛфА+) и без таковой (АЛфА–), в сопоставлении с соответствующими изменениями в ГГНС. Материал и методы. Исследование проведено на 45 белых беспородных крысах-самцах массой 210–240 г, которым интратрахеально вводили 2 штамма S. aureus: АЛфА+ и АЛфА– в дозе 200×106 КОЕ в 0,2 мл изотонического раствора хлорида натрия. В опытах использовали музейные штаммы, выделенные в Институте клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН проф. О. Л. Карташовой. Крысы были разделены на 3 группы. Животные 1-й группы (n=15) были инфицированы S. aureus с АЛфА+, 2-й группы (n=15) — инфицированы штаммом S. aureus с АЛфА–. Контролем служили крысы, которым интратрахеально вводили 0,2 мл изотонического раствора хлорида натрия (n=15). Материал от экспериментальных и контрольных животных брали на 1-, 3-, 7-, 14-е сутки после введения бактерий/стерильного раствора. Исследовали кусочки лёгкого, гипоталамуса (включающие супраоптические и паравентрикулярные ядра) и нейрогипофиза. Для светооптического изучения срезы, полученные после стандартной обработки материала, окрашивали гематоксилином Майера — эозином. Нейросекреторный материал идентифицировали паральдегид-фуксином по Гомори—Габу в модификации А. Л. Поленова [7]. Для электронномикроскопических исследований материал фиксировали в охлаждённом (4 ºС) 2,5% растворе глутаральдегида на S-коллединовом буфере (рН 7,3) с последующей дополнительной фиксацией в 1% растворе четырехокиси осмия по G. Millonig [12]. Затем материал обезвоживали в ацетоне с возрастающей концентрацией и заливали в смесь эпона-812 и аралдита [11]. Полутонкие срезы (толщиной1 мкм) окрашивали метиленовым синим — основным фуксином по методике T. Sato и M. Shamoto [14]. Ультратонкие срезы (40–60 нм) приготавливали на ультратоме LKB-5 (Bromma, Швеция) с контрастированием в насыщенном спиртовом растворе уранилацетата и цитрате свинца [13]. Срезы просматривали и фотографировали при помощи электронного микроскопа ЭМB 100АК (Микроскоп, Украина) при увеличении 6000– 40 000. Для определения внутриядерной фрагментации ДНК использовали набор реактивов «Арорtag Рlus Регохidaze in Situ Apoptosis Detection Kit» (Integrin, Канада) с докрашиванием ядер клеток 0,5% раствором метиленового зеленого на 0,1 М ацетатном буфере. Дегранулированные и заполненные секреторными гранулами нонапептидергические терминали подсчитывали в случайных полях зрения с помощью окулярной сетки Г. Г. Автандилова (256 квадратов) [1] при об. 40, ок. 10 (МБИ-15). Полученные цифровые данные обрабатывали статистически при помощи пакета программ «Statistica 5.5 for Windows» и программного пакета «MS Excel 2003». Значимость различий сравниваемых показателей определяли по t-критерию Стьюдента. Различия между средними величинами считали значимыми при P≤0,05. Результаты исследования. В случае инфицирования крыс микробным штаммом АЛфА– в течение первых 3 сут в слизистой оболочке бронхов среднего и мелкого калибра развивался воспалительный процесс с преобладанием инфильтративно-экссудативных изменений. Незначительные альтеративные изменения проявлялись деструкцией эпителиоцитов, которые слущивались с небольших участков и оказывались в просвете бронхов, где также наблюдалось скопление слизи и лейкоцитов. Изменения в бронхиальном эпителии характеризовались выраженной гиперплазией бокаловидных клеток, что свидетельствовало об усилении мукоидно-секреторных процессов, которые нарастали к 7-м суткам. При этом появлялись полипозные выросты в просвет мелких бронхов, что могло приводить к их обструкции. Описанные изменения в стенках бронхов имели, как правило, мозаичный характер. Их интенсивность возрастала по мере уменьшения диаметра бронхов. На 2-й неделе эксперимента на фоне локальных деструктивных процессов в соединительной ткани собственной пластинки слизистой оболочки бронхов среднего калибра развивалась грануляционная ткань с обилием вновь образованных сосудов микроциркуляторного русла. В условиях интратрахеального введения S. aureus АЛфА+ в первые 3 сут наблюдалось, как и в ранее описанной серии опытов, усиление секреции бокаловидных клеток. В стенке бронхов среднего калибра развивались отёк, плазморрагия, геморрагии, значительно возрастало число лимфоцитов, плазматических клеток, макрофагов, гранулоцитов, тучных клеток. Воспалительные изменения локализовались в основном в подэпителиальной зоне, вокруг концевых отделов и выводных протоков бронхиальных желёз. Инфильтраты, весьма крупных размеров содержали лимфоциты, а также единичные эозинофилы, полиморфноядерные лейкоциты, макрофаги. На 2-й неделе опыта в собственной пластинке слизистой оболочки возрастало число коллагеновых волокон с формированием зон гиалиноза. Отдельные сосуды микроциркуляторного русла имели утолщенные стенки с признаками периваскулярного отёка и склероза. Среди бокаловидных экзокриноцитов обнаруживались клетки, содержащие большое количество лизо-и аутофагосом. К 14-м суткам была отмечена метапластическая перестройка эпителиального пласта. Были обнаружены отдельные участки слизистой оболочки бронхов, покрытые многослойным плоским эпителием (рис. 1). По мере прогрессирования воспалительного процесса в стенке внутрилёгочных бронхов, в их просвете накапливалось значительное количество слизистого и/или слизисто-гнойного содержимого, что усугубляло обструкцию мелких бронхов. У инфицированных крыс на ранних стадиях эксперимента (1–3-и сутки) при светооптическом исследовании в обеих сериях опытов наблюдались явления прогрессирующей инфильтрации легочных альвеол нейтрофилами, лимфоцитами, эозинофилами, плазматическими клетками. Были выявлены признаки разрушения и фрагментации межальвеолярных перегородок. До 3-х суток эксперимента при инфицировании АЛфА– пневмоцитами I типа, сохраняющими свои межклеточные контакты, удерживалась экстравазация плазмы и форменных элементов крови в просвет альвеол. При инфицировании персистентным штаммом бактерий (АЛфА+) данный эффект не наблюдался. При этом отмечались явления дистрофии и некробиоза пневмоцитов (рис. 2), что и усугубляло развитие экссудативного процесса. Некроз пневмоцитов I типа был наиболее выражен в сочетании с фибринозным выпотом в полость альвеол. В этих же зонах легкого наблюдались явления васкулита с тромбозом сосудов микроциркуляторного русла, развитием геморрагических инфарктов. На стадии 14 сут было отмечено разрастание соединительной ткани в области аэрогематического барьера, что приводило к очаговому склерозу в участках воспаления. К 7-м суткам нарастали явления альтерации в терминальных бронхиолах, которые были заполнены фибрином и дегенерирующими лейкоцитами. По периферии зон некроза располагались детритные массы с микроорганизмами, где нередко возникали микроабсцессы. Обнаружено также, что при прямом контакте с S. aureus АЛфА+ клеточные элементы легочных альвеол имели ультраструктурные и иммуноцитохимические изменения. Число клеток с апоптозной доминантой было значительно больше в случае инфицирования бактериями АЛфА+, чем микробами, не обладающими этой активностью. Данная закономерность была прослежена по показателям деградации ДНК, установленной TUNEL-методом (табл. 1). При изучении крупноклеточных ядер гипоталамуса у крыс, подвергнутых интратрахеальному введению бактерий АЛфА–, были идентифицированы функционально активные нейросекреторные клетки (НСК), имеющие крупные ядра и ядрышки, а на уровне аксовазальных контактов в нейрогипофизе обнаружены «пустые» пузырьки, что указывает на активизацию как процессов синтеза, так и экструзии секреторных гранул в общую гемоциркуляцию. В аналогичных условиях инфицирования крыс бактериями АЛфА+, начиная с 7-х суток эксперимента, было выявлено существенное возрастание количества нонапептидергических терминалей НСК, переполненных секреторными гранулами, что демонстрирует феномен задержки высвобождения нейросекрета в микроциркуляторное русло нейрогипофиза (рис. 3, табл. 2). У данных животных в гипоталамусе нередко определялись периваскулярно расположенные полиморфно-клеточные инфильтраты. В структуре супраоптических и паравентрикулярных ядер часто встречались НСК с признаками кариопикноза. Обсуждение полученных данных. К настоящему времени сформулировано положение о том, то морфологические проявления взаимодействий про-и эукариот в основном определяются двумя факторами — уровнем адаптивной активности нонапептидергической ГГНС и персистентным потенциалом микроорганизмов [3, 9]. Наши результаты по изучению ГГНС показали, что в условиях воздействия на организм экспериментальных животных бактерий с высоким персистентным потенциалом (по сравнению с инфицированием АЛфА–) происходит рассинхронизация секреторного цикла нонапептидергических НСК. Суть такого процесса состоит в том, что усиленная продукция нейропептидов не сопровождается адекватной их экструзией в аксовазальный комплекс. Основываясь на наших наблюдениях, мы можем сделать заключение о том, что блокировка высвобождения нейросекрета на уровне терминалей нонапептидергичеких аксонов, наблюдаемая при интратрахеальном введении стафилококка АЛфА+, может привести к дефициту циркулирующих нейрогормонов. Это, в свою очередь, лимитирует реализацию тканями воздухоносных путей и респираторных отделов лёгких своих гисто-и органотипичеких потенций. Так, в условиях интратрахеального введения S. aureus АЛфА+ во внутрилёгочных бронхах наблюдались деструктивные изменения эпителиоцитов, массивные инфильтраты с формированием склеротических изменений в подэпителиальной соединительной ткани, трансформация эпителия в многослойный плоский и появление полиповидных выростов. В этой связи наши данные согласуются с результатами изучения эпителия воздухоносных путей у крыс, инфицированных Е. coli, на фоне длительного эмоционально-болевого стресса [5] и подтверждают концепцию об адаптивной роли нонапептидов ГГНС при воздействиях на организм дестабилизирующих факторов [8]. Известно, что благодаря внутригеномным комбинационным преобразованиям микробы приобрели способность изменять свои свойства и противостоять защитным реакциям макроорганизма, вызывая структурно-функциональную реорганизацию их клеток и тканей на грани срыва адаптации и патоморфологических изменений [3, 4]. Наши данные на примере воздухоносных и респираторных отделов лёгких у крыс, инфицированных стафилококком АЛфА+, подтвердили это положение. Таким образом, мы делаем вывод о том, то диапазон гисто-и органотипических возможностей реснитчатых эпителиоцитов и пневмоцитов зависит не только от функциональных особенностей и фило-эмбриогенетических закономерностей, но и от коррелятивных связей с интерстициальными клеточными элементами органа, подчиненных, в свою очередь, интегрирующим нейроэндокринным факторам организма [3, 5, 8, 9].

作者简介

E. Vakhitov

Orenburg State Medical Academy

Email: tripura@mail.ru

I. Labutin

Orenburg State Medical Academy

Email: LabutinIV@yandex.ru

A. Kozlova

Orenburg State Medical Academy

Email: gistolog32@mail.ru

R. Beznosik

Orenburg State Medical Academy

Email: berova74@rambler.ru

参考

补充文件