STRUCTURAL AND FUNCTIONAL ORGANIZATION OF CART PEPTIDEEXPRESSING NEURONS IN BRAIN AMYGDALA

全文:

Открытый в 1995 г. CART (cocaine-am phetamine-regulated transcript)-пептид [8] первоначально привлек к себе внимание возможным участием в механизмах наркомании [5, 18]. Однако последующие исследования показали, что этот пептид многофункционален [17]. Оказалось, что он присутствует не только в нервной системе, но и в периферических эндокринных органах [12, 19], участвует в процессах нейрогенеза [9], регенерации и бластомогенеза [6, 14, 15]. Столь широкие функции CART-пептида позволяют предполагать, что он вовлечен в обеспечение фундаментальных, жизненно важных процессов клеточного метаболизма, формирование которых произошло на ранних этапах исторического становления организмов. Несмотря на то, что CART-пептид выявлен в различных центрах нервной системы и стал в последние два десятилетия объектом интенсивных исследований, до сих пор остается неизвестным какова нейронная организация экспрессирующих его клеток. Цель настоящего исследования - выявление особенностей нейронной организации CARTпептид-иммунопозитивных нейронов дорсомедиального ядра миндалевидного тела (МТ) мозга. Материал и методы. Исследования проведены на 15 белых половозрелых крысах-самках линии Вистар (головной мозг 6 крыс использован для выявления CART-пептида, 9 - для его обработки по методу Гольджи). Содержали животных и все экспериментальные манипуляции осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ № 755 от 12.08.1977 г. МЗ СССР). Иммуноцитохимическое выявление CART-пептида проводили на приготовленных в криостате СМ 1510 (Leica, Германия) фронтальных срезах мозга толщиной 30 мкм, после перфузии его 1М фосфатным буфером (PBS, рН 7,4) и 4% раствором параформальдегида на 0,1 М PBS. После декапитации животных мозг был дофиксирован в том же фиксаторе в течение 4 ч при температуре 4 ºС, затем его промыли в нескольких порциях 0,9% NaCl на 0,02 M PBS (pH 7,4) и с целью криопротекции помещали в 30% раствор сахарозы на 0,02 М PBS при 4 ºС до полного погружения. Реакцию проводили на свободно плавающих срезах одновременно для всех групп животных. До помещения срезов в 0,3% раствор перекиси водорода (для удаления эндогенной пероксидазы) они были промыты PBS и 0,1% Tween на 0,2 М PBS (Tween-20; Ferak, Германия). Затем в течение 1 ч срезы выдерживали в блокирующем растворе, который содержал 3% бычий сывороточный альбумин (Sigma, США) и 1% козий альбумин (Sigma, США), приготовленные на 0,1% Tween на 0,2 М PBS. После этого срезы инкубировали в растворе первичных поликлональных кроличьих антител к CART (55-102) (H-003-62, PhoeniхPharm., Incorp, США), разведенные 1:8000 на 1% BSA при 4 ºC в течение 48 ч. Далее срезы промывали при комнатной температуре в трех порциях PBS с Tween по 20 мин и в течение 2 ч инкубировали во вторичных goat-anti-rabbit антителах, конъюгированных с авединовым комплексом (ABC-kit 689321, ICN Biomedicals Inc., США). После промывания срезов в 3 порциях PBS с Tween их помещали на 2 ч в пероксидазо-антипероксидазный комплекс, конъюгированный со стрептавидином (ABC-kit 689321, ICN Biomedicals Inc., США). Затем срезы промывали в 3 порциях PBS по 15 мин и помещали на 10 мин в 0,05% раствор диаминобензидина (Sigma, США) с 0,015% перекисью водорода, разведенной на PBS. Вновь срезы промывали в нескольких порциях PBS, помещали на стекла с полилизиновым покрытием (SuperFrost/plus, Menzel-Glazer, Германия) и высушивали при комнатной температуре. После обработки в 3 порциях 96º этанола и 3 порциях ксилола срезы заключали в канадский бальзам под покровное стекло. Особенности нейронной организации структур исследовали на фронтальных срезах мозга толщиной 100 мкм, обработанных по методу Гольджи. Для этого мозг после фиксации в жидкости Мюллера и дополнительной фиксации в смеси двухромовокислого калия и четырехокиси осмия выдерживали в 1% растворе нитрата серебра 10 сут в термостате, после чего обезвоживали в нескольких порциях этанола возрастающей концентрации, заливали в целлоидин, и готовили срезы. Микрофотографии изготавливали с помощью светового микроскопа Leica DMD 108 (Leica, Германия) со специализированным программным обеспечением для управления настройками микроскопа и захвата изображения с возможностью его сохранения на встроенной карте памяти 64 MB. Полученные изображения экспортировали в компьютер СМ1740 ASUS. Принадлежность нейронов к I или II типу по Гольджи определяли на основании классификационных признаков, разработанных Т. А. Леонтович [3] для подкорковых нейронов. Результаты исследования. Дорсомедиальное ядро МТ находится в медиобазальном углу полушария конечного мозга, примыкая к нижнему рогу бокового желудочка. Оно образовано плотно расположенными нейронами преимущественно малого и среднего размера. CART-пептид-позитивные нейроны располагаются в различных его частях. Нейроны малого размера локализуются в субэпендимных зонах. Они имеют округло-овальные тела и 1 или 2 коротких отростка (рисунок, а, б). Если у нейронов выявляются 2 отростка, то они, как правило, отходят от противоположных полюсов перикариона и не ветвятся. В тех случаях, когда определяется 1 короткий отросток, недалеко от тела клетки он делится на 2 тонкие незначительной длины веточки. Нейроны среднего размера, дающие более интенсивную иммуноцитохимическую реакцию на CART-пептид (см. рисунок, в), занимают центральные зоны дорсомедиального ядра. Они обладают более массивными телами, формируют небольшие группы. CART-пептид выявляется в телах этих нейронов, маскируя клеточное ядро, или в одном из отростков. Исследование нейронной организации дорсомедиального ядра показало, что нейроны в субэпендимных зонах имеют характер нейробластоформных (см. рисунок, г, д), характеристика которых идентична CART-позитивным нейронам этой зоны дорсомедиального ядра. Для них характерно небольшое тело и наличие не более двух неразветвленных дендритов. В центральных зонах ядрá нейроны имеют характер короткодендритных. У них в импрегнированных нитратом серебра препаратах выявляются от 2 до 4 коротких первичных дендритов, которые отходят либо от полюсов тела (чаще всего в этих случаях 2 дендрита), либо от разных мест поверхности тела. На небольшом расстоянии от тела они разделяются на ветви, которые больше не ветвятся, и снабжены шипиками. Тело короткодендритных нейронов - округлой формы (см. рисунок, е, ж). Наличие особенностей регионального распределения CART-пептид-позитивных нейронов и нейронов, выявленных методом Гольджи, позволяет заключить, что CART-пептид-позитивные нейроны субэпендимной зоны дорсомедиального ядра являются нейробластоформными, а дающие положительную реакцию на CART-пептид нейроны центральных зон - короткодендритными. Полученные результаты указывают на то, что CART-пептид экспрессируется в нейронах, относящихся к редковетвистой нейронной системе. Обсуждение полученных данных. Учение о редко-и густоветвистой нейронной системах создано Т. А. Леонтович [3] на основе результатов исследований нейронной организации подкорковых центров мозга, выполненных на разных представителях позвоночных. Показано, что в филогенетически древних отделах нервной системы преобладают длинноаксонные редковетвистые нейроны, в отделах, формирование которых происходит на более поздних этапах эволюции мозга, вследствие возрастания интегративных свойств нейронов, преобладающим их типом становятся густоветвистые. Согласно классификации Т. А. Леонтович [3], к длинноаксонным редковетвистым нейронам (I типа Гольджи) относятся нейробластоформные, короткодендритные и ретикулярные нейроны. Среди них самыми древними считаются нейробластоформные, получившие свое название на основании их визуального сходства с нейробластами. Характеристики этих нейронов указывают на то, что они являются эквивалентами прогениторных клеток. Это подтверждено результатами исследований А. Yachnis и соавт. [20], выявивших наличие частично коммитированных клеток-предшественников нейронов в перивентрикулярной зоне заднего отдела МТ человека, а также Y. Luo и соавт. [15], изучавших характеристики прогениторных клеток в ростральной части (расположенной под дорсальным гиппокампом) субвентрикулярной зоны крыс. Короткодендритные нейроны, как подсказывает их название, имеют небольшую длину дендритов, крупнее нейробластоформных, на дендритах часто встречаются шипики. Эти нейроны распространены в гипоталамической области, которая, как известно, является одним из наиболее изученных нейроэндокринных центров мозга, а также выявлены и в медиальных зонах МТ [3]. Представители редковетвистой нейронной системы в примыкающих к гипоталамической области медиальных отделах МТ, выявленные указанным автором у собак, обнаружены и у крыс [1]. Результаты ранее проведенных электронномикроскопических исследований [2] показали, что нейроны дорсомедиального ядра МТ обладают характеристиками нейроэндокринных нейронов. Известно, что CART-пептид, кроме ЦНС, периферического отдела нервной системы и ганглиев автономной нервной системы [16], экспрессируется в эндоэпителиальных эндокриноцитах диффузной гастроэнтеральной [7, 10, 12] и мочеполовой системы [11]. Показано, что в поджелудочной железе он выявляется не только в ее эндокринной части, но и в экзокринной [13], что свидетельствует о появлении CART-пептида на ранних этапах становления регуляторной химической коммуникации, так как экзокринная секреция рассматривается как наиболее филогенетически древняя, исходная для всех эндокринных и нейроэндокринных элементов [4]. На основании предложенной этим автором концепции о путях становления в филогенезе Metazoa нейроэндокринной и эндокринной систем, можно полагать, что CART-пептид существовал у общего «предка» пронейроцитов и проэндокриноцитов - малодифференцированных клеток протогормонального типа, т.е. присутствовал на раннем этапе прогормонального периода, характерного для Metazoa, еще не обладающих нервной системой. Именно такое представление дает ключ к пониманию столь широкого представительства CART-пептида в нейроэндокринной системе и снимает вопросы при интерпретации его функционального значения. Итак, полученные нами данные свидетельствуют о том, что экспрессирующие CART-пептид нейроны дорсомедиального ядра МТ у крысы являются, по классификации Т. А. Леонтович [3], нейробластоформными и короткодендритными.

作者简介

A. Akhmadeyev

Bashkir State University

Email: mpha@ufanet.ru

L. Kalimullina

Bashkir State University

参考

补充文件