METHOD FOR SIMULTANEOUS VISUALIZATION OF MAST CELLS AND NERVE TERMINALS IN THE RODENT THYMUS

全文:

То, что нервная и иммунная системы функционируют в тесной кооперации, оказывая друг на друга взаимное влияние, не вызывает сомнений [2]. Одним из примеров такого взаимодействия является описанная взаимосвязь тучных клеток (ТК) и терминалей нервных волокон [15, 17]. Совместная локализация ТК и нервных окончаний показана в миокарде, диафрагме, мозговых оболочках, желчном пузыре, подвздошной кишке и коже млекопитающих. Особое внимание в настоящее время уделяется роли их взаимодействия в патогенезе различных заболеваний, таких как слизистый колит, бронхиальная астма, псориаз и др., вследствие чего наиболее изученными оказываются пищеварительный тракт, воздухоносные пути и кожа [10]. Исследования тимуса, связанные с совместной локализацией ТК и нервных волокон, преимущественно относятся к 80-90-м годам ХХ в. [8, 13, 14, 16, 18, 19] и выполнены с использованием таких трудоемких и часто плохо воспроизводимых методов и подходов, как импрегнация нервных волокон солями металлов [16], а также методов с применением глиоксиловой кислоты [8, 9, 19]. Помимо плохой воспроизводимости, недостатком упомянутых методик является то, что они позволяют выявлять нервные волокна и не пригодны для визуализации синаптических контактов. Способность выявлять именно терминали нервных волокон является принципиально важной в случае взаимодействия ТК с нервными волокнами. В иммуногистохимических исследованиях для идентификации нервных волокон используют антитела к определенным нейропептидам, таким как субстанция Р, CGRP, VIP, нейропептид Y и др. [12-14], или антитела к ферментам, катализирующим синтез норадреналина и дофамина - тирозингидроксилазе и др. [14, 18]. Это позволяет выявлять нервные волокна только определенной медиаторной принадлежности и не дает возможности оценить общее количество контактов ТК с нервными терминалями в пределах единого среза. Целью настоящего исследования была разработка простого и хорошо воспроизводимого метода одновременного выявления ТК и нервных терминалей, основанного на комбинации метода гистохимической идентификации ТК альциановым синим и иммуногистохимической реакции выявления синаптофизина (СФ). СФ является главным интегральным белком мембраны синаптических пузырьков и используется как специфический маркер синапсов. Иммуногистохимическое окрашивание с использованием моно-и поликлональных антител к СФ - простой и надежный метод, который применяется для оценки синаптогенеза, плотности расположения синапсов в нервной системе, а также для изучения иннервации внутренних органов у млекопитающих [5-7]. Большинство методов идентификации ТК основаны на гистохимическом выявлении компонентов их гранул. Одной из таких методик, широко используемой в гистологической практике, является окраска альциановым синим, который, будучи катионным красителем, за счет образования ионных связей с полианионами гликозаминогликанов способен связываться с гепарином и хондроитинсульфатами в составе гранул ТК, окрашивая их в синий цвет [3]. В качестве объекта исследования в данной работе был использован тимус половозрелых крыс линии Вистар и мышей линии C57BL. Содержание лабораторных животных и их умерщвление проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приложение к приказу № 755 МЗ СССР от 12.08.1977 г.). Материал фиксировали в цинк-этанолформальдегиде [1] и в смеси СФУ (96 º спирт, 6 частей; 40% формальдегид, 3 части; ледяная уксусная кислота, 1 часть) в течение 24 ч и после стандартной гистологической проводки заливали в парафин (НеваРеактив, Россия; Histomix, БиоВитрум, Россия). Срезы толщиной 5 мкм наклеивали на предметные стекла, покрытые поли-L-лизином (Menzel, Германия) или специальным адгезивом [4]. Для выявления СФ использовали поликлональные кроличьи антитела (Dako, Дания; Monosan, Нидерланды), в качестве вторичных реагентов - HRP Conjugate из набора Reveal Polyvalent HPR DAB Detection System SPD-015 (Spring Bioscience, США). Для выявления продукта реакции применяли хромоген 3’3-диаминобензидин из двухкомпонентного набора (Spring Bioscience, США). Для идентификации ТК срезы докрашивали коммерческим раствором альцианового синего (BioVitrum, Россия). В результате отработки различных режимов инкубации с антителами, проверки необходимости процедуры теплового демаскирования антигена и варьирования времени окрашивания альциановым синим был установлен следующий оптимальный протокол обработки препаратов: 1) удалить парафин и регидратировать срезы обычным способом; 2) после промывки в дистиллированной воде (2-5 мин) предметные стекла перенести в 3% перекись водорода на 5-7 мин для блокирования эндогенной пероксидазы; 3) поместить стекла в 0,01 М фосфатно-солевой буфер (ФСБ), рН 7,4, на 2-3 мин; 4) удалить избыток жидкости вокруг срезов фильтровальной бумагой; 5) нанести на срезы необходимое количество блокирующего раствора (Protein block DPB-125, Spring Bioscience, США) и оставить при комнатной температуре на 10 мин. Чтобы реагенты при инкубации не растекались по предметному стеклу и срезы не высыхали, рекомендуется нарисовать специальным фломастером (Liquid Blocker, PAP Pen, Dako Pen) гидрофобный круг вокруг срезов; 6) удалить блокирующий раствор и, не промывая препараты, нанести на срезы антитела к СФ, равномерно распределив раствор по срезу покачиванием. Поместить стекла во влажную камеру и инкубировать при 27 º C в течение 50 мин; 7) промыть препараты в ФСБ в течение 5-7 мин; 8) удалить избыток жидкости вокруг срезов и нанести необходимое количество реагента HRP Conjugate из набора Reveal Polyvalent HPR DAB Detection System. Поместить стекла во влажную камеру и инкубировать при 27 °C в течение 15 мин; 9) смыть реагент со срезов и оставить препараты в ФСБ на 10 мин; 10) удалить избыток ФСБ и нанести на срезы необходимое количество рабочего раствора DAB. В течение 1-3 мин происходит образование продукта гистохимической реакции. Контролируя данный процесс под микроскопом, следует остановить реакцию до появления окрашенного фона, смыв раствор хромогена 3% перекисью водорода; 11) промыть препараты в дистиллированной воде (2-5 мин); 12) удалить избыток жидкости со стекла и промокнуть фильтровальной бумагой область вокруг срезов; 13) докрасить срезы альциановым синим одним из двух предлагаемых способов, различающихся по конечному результату окрашивания. Прогрессивное окрашивание: а) поместить стекла в раствор альцианового синего и оставить на 30 мин при комнатной температуре; б) промыть, покачивая, в двух сменах дистиллированной воды; в) обезводить, просветлить и заключить препараты в перманентную среду (DPX, полистирол, канадский бальзам) обычным способом. Регрессивное окрашивание с дифференцировкой в ледяной уксусной кислоте (ЛУК): а) на срезы нанести капельно необходимое количество раствора альцианового синего (чтобы раствор красителя полностью покрыл каждый срез); б) нагреть стекло со срезами и раствором красителя над пламенем спиртовки (или другим способом) и окрашивать до достижения интенсивной темно-синей окраски срезов; в) переместить предметное стекло в дистиллированную воду и промыть покачиванием; г) удалить со стекла избыток жидкости и нанести капельно на срезы ЛУК. В течение нескольких секунд происходит отмывка срезов от избытка красителя (дифференцировка). Как только срезы станут неокрашенными для невооруженного глаза, дифференцировку необходимо прекратить, переместив стекла в дистиллированную воду и промыв покачиванием; д) обезводить, просветлить и заключить препараты в перманентную среду (DPX, полистирол, канадский бальзам) обычным способом. Сравнение результатов обработки препаратов, фиксированных разными способами, показало, что фиксация в цинк-этанол-формальдегиде лучше сохраняет иммунореактивность изучаемого антигена и способствует более яркому окрашиванию компонентов ткани альциановым синим, чем фиксация в СФУ. В результате обработки на препаратах отчетливо выявляются СФ-положительные терминали (СФПТ) нервных волокон. Результаты иммуногистохимического выявления нервных терминалей по селективности и интенсивности окраски сопоставимы с результатами других исследований, проведенных с применением антител к СФ [5-7]. Идентифицируемые по интенсивному окрашиванию реактивом в темно-коричневый или черный цвет СФПТ обнаруживаются, преимущественно, в пределах соединительной ткани капсулы и септ тимуса, субкапсулярно и вокруг кровеносных сосудов, где часто формируют сплетения. ТК отчетливо выявляются за счет интенсивного окрашивания их цитоплазматических гранул альциановым синим в бирюзово-синий цвет. Обнаруженные ТК характеризуются сравнительно крупными размерами (длиной 10-20 мкм, шириной 6-9 мкм), овальной или удлиненной, реже - сферической формой, Тучные клетки (ТК) и синаптофизин-позитивные терминали (СФПТ) нервных волокон в тимусе. а, б - субкапсулярная область тимуса крысы; в-г - междолевая соединительная ткань тимуса мыши; длинные стрелки - СФПТ; короткие стрелки - ТК; звездочка - полость сосуда. Иммуногистохимическая реакция на синаптофизин с докраской альциановым синим: а, б - прогрессивное окрашивание; в-г - регрессивное окрашивание с дифференцировкой присутствием несколько эксцентрично расположенного крупного ядра, иногда закрытого гранулами. ТК в тимусе локализуются, как и нервные терминали, в пределах капсулы и септ, субкапсулярно и периваскулярно. СФПТ часто располагаются в непосредственной близости к ТК, что создает впечатление существования в тимусе контактов между ними. Окрашивание препаратов альциановым синим без последующей дифференцировки в ЛУК (вариант прогрессивного окрашивания) улучшает ориентацию в структурах препарата, не маскируя при этом продукта иммуногистохимической реакции. На общем голубовато-бирюзовом фоне, который создают окрашенные альциановым синим ядра лимфо-, эндотелио-и эпителиоцитов, компоненты соединительной ткани, ТК выделяются за счет более интенсивного ярко-синего окрашивания (рисунок, а, б). В результате дифференцировки препаратов в ЛУК (вариант регрессивного окрашивания) все структуры тимуса, кроме ТК и СФПТ, не окрашены. На результат иммуногистохимической реакции и окраску гранул ТК дифференцировка в ЛУК не влияет, вследствие чего ТК более контрастно (по сравнению с таковыми при использовании предыдущего варианта окрашивания) выявляются на неокрашенном фоне, что облегчает их обнаружение и подсчет (см. рисунок, в, г). Представленный протокол обработки позволяет с высокой избирательностью и хорошей воспроизводимостью одновременно выявлять в пределах среза ТК и терминали нервных волокон в тимусе лабораторных млекопитающих. Полученные в ходе настоящей работы результаты согласуются с имеющимися данными о присутствии в тимусе контактов ТК с терминалями нервных волокон [9, 12-14, 16, 19]. К преимуществам представленного метода (помимо селективности и воспроизводимости) можно отнести специфичность в отношении терминалей нервных волокон любой медиаторной принадлежности, в то время как уже известные иммуногистохимические методики, связанные с использованием антител к нейропептидам, позволяют выявлять нервные волокна только определенной медиаторики [12-14]. В работе V.A. Botchkarev и соавт. [11] представлен метод тройного окрашивания, основанный на одновременном использовании антител к SP и CGRP для выявления нервных волокон, и TRITC-или FITC-меченого авидина для идентификации ТК. Данная методика, хотя и позволяет одновременно выявлять и SP-, и CGRP-содержащие нервные волокна и таким образом расширяет область исследования, является трудоемкой - требует тщательного подбора флюорохромов с неперекрывающимися спектрами свечения, а также использования большого количества разнообразных реагентов. В отличие от подобных методик, связанных с привлечением трудоемких и дорогостоящих методов конфокальной или электронной микроскопии, разработанный нами протокол окрашивания относительно прост и позволяет использовать парафиновые срезы и световую микроскопию. Наконец, разработанная методика применима не только для визуализации пространственного взаимоотношения ТК и СФПТ, но и для самостоятельного исследования иннервации различных органов млекопитающих.

作者简介

V. Gusel’nikova

St. Petersburg State University

Ye. Sukhorukova

RAMS North-Western Branch Institute of Experimental Medicine

Email: len48@inbox.ru

Ye. Fyodorova

RAMS North-Western Branch Institute of Experimental Medicine

A. Polevshchikov

RAMS North-Western Branch Institute of Experimental Medicine; Far-Eastern Federal University

D. Korzhevskiy

RAMS North-Western Branch Institute of Experimental Medicine; St. Petersburg State University; St. Petersburg State University

Email: dek2@yandex.ru

参考

补充文件