ULTRASTRUCTURAL CHANGES IN BRAIN HISTAMINERGIC NEURONS UNDER THE INFLUENCE OF ALCOHOL

全文:

Гистаминергические нейроны были описаны в мозгу животных и человека около 30 лет назад. Их тела располагаются только в задней гипоталамической области, образуя 5 скоплений - ядер (Е1-Е5), аксоны от которых идут во все отделы мозга, регулируя активность других нейромедиаторных систем. Накоплено большое количество данных об их строении, функциях, развитии в филогенезе и онтогенезе, участии в регуляции многих функций, процессов и систем организма [1, 10]. В литературе имеются данные о влиянии алкоголя на метаболизм гистамина в мозгу и об особенностях гистаминергической системы мозга у животных с различной врожденной устойчивостью и влечением к алкоголю [2, 13]. Однако влияние этанола на гистаминергические нейроны мозга микроскопическими методами не изучено. Целью настоящей работы явился анализ ультраструктурных изменений, развивающихся в гистаминергических нейронах мозга при однократном (остром), многократном (подостром) и хроническом воздействии алкоголя. Материал и методы. В работе использован материал от 24 беспородных белых крыс-самцов массой 175±25 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария. Все опыты выполнены с учётом «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приложение к приказу № 755 от 12.08.1977 г. МЗ СССР). На данное исследование получено разрешение этического комитета Гродненского государственного медицинского университета. При остром воздействии животные получали 20% раствор этанола внутрибрюшинно, однократно, в дозе 1 г/кг (малая) и 4 г/кг (большая, наркотическая), после чего их выводили из эксперимента декапитацией спустя 1 и 6 ч. При подостром воздействии животные получали этанол в дозе 4 г/кг ежедневно в течение 7 сут, их умерщвляли через 24 ч после последнего введения. При хроническом воздействии крысы в течение 6 мес получали 20% раствор этанола в качестве единственного источника питья [потребление его составляло 2-3 г/(кг/сут)]. Контрольные животные получали параллельно инъекции изотонического раствора хлорида натрия в таком же объеме или потребляли вместо раствора этанола воду. После декапитации быстро извлекали головной мозг, кусочки заднего отдела гипоталамуса, содержащие гистаминергические нейроны ядрá Е2, фиксировали в глутаральдегиде, 1% OsO4, обезвоживали и заключали в эпоксидную смолу. Расположение гистаминергических ядер определяли с помощью стереотаксического атласа [14] и топографических схем [3, 11]. На ультрамикротоме МТ-7000 (RMC, США) готовили срезы, контрастировали их уранилацетатом и цитратом свинца, изучали в электронном микроскопе JEM-1011 (JEOL, Япония), фотографировали с помощью цифровой камеры (Olympus MegaView III, Германия). Морфометрию проводили, используя программу для обработки изображений iTEM (Olympus Soft Imaging Solutions, Германия), при этом обводили курсором на мониторе компьютера цитоплазму гистаминергических нейронов, а также митохондрии и лизосомы, подсчитывали количество и оценивали размеры и форму данных органелл. В каждом случае в контрольной и подопытной группе измерения проводили на электронномикроскопических фотографиях 30 нейронов. Измеренные параметры органелл на каждом снимке пересчитывали на 100 мкм2 площади цитоплазмы гистаминергических нейронов. Полученные результаты анализировали методами непа раметрической статистики с помощью программы Statistica 6.0 для Windows (StatSoft, Inc., США). Результаты исследования. У контрольных крыс в ядрах гистаминергических нейронов выявляются преимущественно мелкодисперсный хроматин и центрально расположенные ядрышки; перинуклеарное пространство не расширено. Цитоплазма этих нейронов богата органеллами. Митохондрии овальной и круглой формы, преимущественно средних размеров, с плотно расположенными кристами. Хорошо развита гранулярная эндоплазматическая сеть, цистерны которой не расширены и располагаются упорядоченно. В цитоплазме выявляется значительное количество свободных рибосом, преимущественно в виде полисом. Хорошо развит комплекс Гольджи, представленный как плоскими цистернами, так и большим количеством вакуолей и пузырьков. Выявляются первичные мелкие лизосомы, заполненные гомогенным веществом равномерной электронной плотности, и единичные вторичные лизосомы малых и средних размеров с гетерогенным зернистым содержимым (рисунок, а). При введении животным этанола в гистаминергических нейронах мозга обнаруживаются разнообразные ультраструктурные изменения как общие для всех режимов введения, так и зависящие от дозы, срока после введения и продолжительности воздействия алкоголя. Так, независимо от дозы и продолжительности введения, этанол приводит к гипертрофии и перемещению ядрышек к ядерной оболочке, скоплению электронноплотного гранулярного материала (возможно, субъединиц рибосом) между ядрышком и ядерной оболочкой, перемещению его в цитоплазму (см. рисунок, б), увеличению складчатости ядерной оболочки, расширению перинуклеарного пространства, увеличению числа ядерных пор и даже к локальному разрушению ядерной оболочки. В случае 7-суточного введения алкоголя в дозе 4 г/кг в ядрах гистаминергических нейронов были обнаружены вакуоли, полости неправильной формы с гомогенным электронно-прозрачным содержимым, окружённые мембраной (см. рисунок, в). Через 1 ч после введения малой дозы и через 24 ч после последнего 7-суточного введения наркотической дозы алкоголя в цитоплазме отдельных гистаминергических нейронов выявляются структуры круглой или овальной формы, размером около 1-2 мкм, иногда частично окружённые ядерной оболочкой и состоящие из гранулярного осмиофильного материала с участками просветления, очень напоминающие ядрышки - ядрышкоподобные тельца (см. рисунок, г). Ещё одним ультраструктурным феноменом, особо часто наблюдаемым в цитоплазме гистаминергических нейронов при однократном или многократном воздействии алкоголя в большой дозе, является замыкание стопок цистерн комплекса Гольджи в кольца, а также появление в цитоплазме нейронов необычных слоистых структур и миелиноподобных фигур (см. рисунок, д). Большая доза алкоголя и хроническое его потребление приводят к расширению каналов эндоплазматической сети (см. рисунок, б, в), к значительному увеличению числа свободных рибосом (см. рисунок, г). При этом всегда происходит гипертрофия, а иногда и гиперплазия митохондрий, сопровождаемая их набуханием, с фрагментацией и деструкцией крист (см. рисунок, б, д). Иногда наблюдаются поперечные перетяжки митохондрий, особенно спустя 1 ч после однократного введения крысам алкоголя (см. рисунок, е); происходит увеличение их числа (на 59%) и средней площади (на 56%). Спустя 6 ч после введения наркотической дозы алкоголя, средняя площадь митохондрий остается повышенной (на 22%). После 7-суточной алкогольной интоксикации число этих органелл возрастает на 20%, а относительная их площадь - на 27%. Хроническая алкоголизация приводит к увеличению средней площади митохондрий на 27%. Иногда гипертрофированные митохондрии скапливаются и тесно прилежат к ядру, эндоплазматической сети или комплексу Гольджи (см. рисунок, б, д). Во всех экспериментах воздействие алкоголя приводит к гипертрофии и гиперплазии лизосом. Хотя через 1 ч после введения этанола в малой дозе количество и размеры лизосом увеличиваются незначимо, через 1 ч после введения его в большой дозе количество лизосом на единице площади цитоплазмы гистаминергических нейронов возрастает на 85%, а их относительная площадь - в 2 раза. Через 6 ч после введения алкоголя в дозе 4 г/кг число лизосом увеличивается на 61%, а относительная площадь - на 33%. При 7-суточной алкогольной интоксикации количество этих органелл на единице площади цитоплазмы и относительная площадь возрастают в 2 раза, а средняя площадь увеличивается на 50%. При хроническом потреблении алкоголя число лизосом увеличивается в 4 раза, средняя площадь - на 60%, а относительная площадь - в 2 раза. Обсуждение полученных данных. Теоретически, гистаминергические нейроны должны быть очень чувствительны к этанолу, поскольку все аминергические нейроны мозга способны активно окислять алкоголь (с помощью фермента каталазы) и накапливать его токсический метаболит - ацетальдегид (из-за низкой активности в них фермента, окисляющего ацетальдегид, - альдегиддегидрогеназы) [15]. Этим объясняются описанные выше повреждения ультраструктур гистаминергических нейронов, что соответствует на светооптическом уровне появлению большого числа гиперхромных нейронов, клеток-теней и гибели до 5% нейронов после субхронического и хронического воздействия алкоголя [4, 8]. С другой стороны - на ультраструктурном уровне в гистаминергических нейронах хорошо выражены компенсаторные и адаптационные изменения, направленные на поддержание жизнеспособности этих важных нервных клеток, а значит, и всего организма в условиях алкогольной интоксикации. Так, гипертрофия и перемещение ядрышек к ядерной оболочке, усиленное образование и выход в цитоплазму субъединиц рибосом, расширение перинуклеарного пространства, возрастание складчатости оболочки ядра и числа ядерных пор могут отражать активацию ядерного аппарата исследуемых нейронов для усиления биосинтеза белков и других соединений в клетке. Этому же служат гипертрофия и гиперплазия эндоплазматической сети, относительное увеличение числа свободных рибосом. Последнее может свидетельствовать о переключении синтетического аппарата на обеспечение собственных нужд клетки для восполнения утраченных структур в процессе адаптации к токсическому воздействию [7]. Ядрышкоподобные тельца в цитоплазме гистаминергических нейронов, выявляемые после введения этанола, были описаны ранее в нейронах и олигодендроцитах гипоталамической области при различных экспериментальных воздействиях [12], а также в нейронах передней амигдалярной области у гонадэктомированных крыс [9]. Биологический смысл появления ядрышкоподобных телец может быть следующим. При введении этанола возникает необходимость в быстрой адаптационной перестройке гистаминергических нейронов. Для этого необходим синтез большого количества белков (как ферментных, так и структурных), чему должно предшествовать быстрое образование большого числа рибосом в цитоплазме, субъединицы которых образуются в ядрышках, массово перемещаются в цитоплазму и иногда образуют там центры агрегации с образованием ядрышкоподобных структур в нуждающихся отделах клетки [9]. Такие тельца, содержащие субъединицы рибосом, в цитоплазме описаны также как «стрессорные гранулы» [6]. Они возникают в клетках, в том числе и нейронах, в ответ на стресс, и представляют собой скопления неполных инициаторных комплексов, содержащих связанную с белками иРНК и малые субъединицы рибосом. Функциональное значение данных гранул остается непонятным. Возможно, их роль состоит в подавлении трансляции определенных иРНК, препятствующем их быстрой деградации в цитоплазме. Стрессорные гранулы можно представить как неполные инициаторные комплексы [6]. Образование в ядре вакуолей - полостей неправильной формы с гомогенным содержимым, окружённых мембраной, наблюдавшееся после многократного введения большой дозы этанола, ранее отмечено в других типах нейронов при развитии в них деструктивных процессов [7]. С нашей точки зрения, это может быть следствием расширения перинуклеарного пространства с отшнуровываниями внутренней ядерной мембраны. Появление в гистаминергических нейронах слоистых, миелиноподобных фигур, наблюдаемых при алкогольной интоксикации, является признаком напряженного функционирования клеток и даже их истощения [7] и коррелирует на светооптическом уровне с увеличением числа гиперхромных нейронов и клеток-теней при воздействии этанола [5, 8]. Несмотря на деструктивные изменения в митохондриях при больших дозах этанола (что соответствует снижению активности дегидрогеназ сукцината и NADН в цитоплазме гистаминергических нейронов на светооптическом уровне), многие из них гипертрофированы, с повышенной плотностью расположения крист. Такие предположительно гиперактивные митохондрии скапливаются вблизи ядерной оболочки, гипертрофированных комплекса Гольджи и эндоплазматической сети, вероятно, обеспечивая повышенную потребность ядра и органелл в энергии [7]. Это может быть связано с увеличением энергозатрат в клетке, необходимых для усиления синтетических процессов, обеспечивающих их адаптацию к воздействию алкоголя. О напряжённом функционировании нейронов свидетельствует и увеличение числа и площади митохондрий при всех режимах воздействия алкоголя. Гипертрофия и гиперплазия лизосом, сопровождаемые активацией их маркерного фермента - кислой фосфатазы в цитоплазме гистаминергических нейронов [4, 5, 8], очевидно, отражают усиление процессов аутофагии, направленных на удаление поврежденных мембран и органелл нейронов в условиях токсического действия на последние алкоголя и адаптации к нему. Активация ядерного аппарата и гипертрофия различных органелл гистаминергических нейронов, тесные контакты митохондрий с ядром и другими органеллами, особенно через 6 ч после введения алкоголя, трактуются как отражение усиленного функционирования нейронов [7]. Таким образом, при введении в организм алкоголя в гистаминергических нейронах мозга развиваются разнообразные ультраструктурные изменения, отражающие процессы деструкции, повреждения, а также адаптационные изменения, направленные на восстановление и поддержание их функций и являющиеся признаками защитных реакций организма, необходимых для поддержания гомеостаза в создавшихся условиях токсического воздействия алкоголя. Эти изменения зависят от дозы, срока после введения и продолжительности воздействия алкоголя и в целом соответствуют выявленным на светооптическом уровне структурным и гистохимическим изменениям. По отдельности все они имеют неспецифический характер, поскольку описаны при разных экспериментальных воздействиях и в других типах нейронов.

作者简介

S. Zimatkin

Grodno State Medical University

Email: zimatkin@grsmu.by

Ye. Fedina

Grodno State Medical University

参考

补充文件