PECULIARITIES OF THE DISTRIBUTION OF ACETYLCHOLINESTERASE IN THE LATERAL POSTERIOR NUCLEUS OF THE THALAMUS OF THE CAT

全文:

Передача информации из сетчатки глаза в кору мозга осуществляется, главным образом, через таламические ядра, у кошки - через комплекс заднелатеральных ядер (ЗЛЯ) и ядер подушки. Комплекс ЗЛЯ состоит из двух ядер: латерального (ЗЛЯл) и медиального (ЗЛЯм), это деление основано на доминировании определённых проекций на эти структуры: из передних холмиков крыши среднего мозга - в ЗЛЯм и из первичной зрительной коры - в ЗЛЯл. Таким образом, ЗЛЯл, в отличие от других ядер в комплексе ЗЛЯ - подушка, получает бóльший объём афферентных волокон из зрительной коры [5]. Известно, что нейроны, связывающие это ядро со зрительной корой, распределены в нём не равномерно, но группируются в кластеры [2]. Зачастую кластеры инициальных нейронов являются основой модульной организации структуры, как это показано для коры, однако в ЗЛЯл до сих пор не обнаружена модульная организация, и это ядро рассматривали, скорее, как однородное по свойствам и химизму. Поскольку таламокорковые отношения закладываются в позднем пренатальном - раннем постнатальном онтогенезе, мы предположили, что основу упорядоченной организации инициальных нейронов ЗЛЯл следует искать у незрелых животных. В этом поиске мы обратили внимание на ацетилхолинэстеразу (АХЭ) - фермент, катализирующий гидролиз ацетилхолина. Ацетилхолин является не только нейромедиатором, но и нейромодулятором и контролирует процесс построения межнейронных связей [7], во время раннего развития в некоторых зрительных структурах обнаруживается врéменное неравномерное распределение продукта гистохимической АХЭ-реакции, которое у взрослых животных исчезает [8]. Цель нашего исследования - изучение распределения АХЭ в ЗЛЯл у котят. Материал и методы. Протоколы экспериментов были одобрены комиссией по этике Института физиологии им. И. П. Павлова РАН и выполнялись в соответствии с требованиями Директивы Совета Европейского Парламента по защите животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (2010/63EU) об использовании животных для экспериментальных исследований. Исследование проведено на 8 нормально пигментированных котятах в возрасте 2 (n=4) и 14 (n=4) нед, росших в обычных виварных условиях. Под общим наркозом (золетил внутримышечно, 150 мг/кг) проводили транскардиальную перфузию животных, последовательно 0,9% раствором хлорида натрия и 4% параформальдегидом на 0,1 М фосфатном буфере. Извлеченный мозг помещали в 30% раствор сахарозы на 2 сут, на замораживающем микротоме OMS-69 (Reichert, Германия) изготавливали серию фронтальных срезов таламуса толщиной 50 мкм. АХЭ выявляли с помощью гистохимического модифицированного метода Карновского-Рута [9]. После промывки срезов в 0,1 M малеатном буфере (pH 6,3) срезы преинкубировали в растворе, содержащем 3,15 мM хлорида кобальта, 5 мM цитрата натрия и 2,5 мM ферроцианида калия в 0,1 M малеатном буфере (pH 6,3). После 30-минутной преинкубации срезы переносили во вторую порцию раствора, содержащего также смесь 160 мM ацетилхолинйодида и 40 мM ацетилтиохолинйодида. Длительность инкубации составляла 24 ч при 4º C. По окончании инкубации срезы промывали в малеатном буфере, монтировали на желатинизированные предметные стёкла, высушивали на воздухе, обезвоживали, просветляли в ксилоле и заключали в канадский бальзам. Продукт реакции представлял собой преципитат изумруднозелёного цвета. Оцифровку срезов и морфометрический анализ проводили с помощью компьютерной установки, оснащенной световым микроскопом Jenaval (Carl Zeiss, Германия), камерой Optronix (Baumer Optronic GmbH, Германия). Морфометрический анализ проводили в свободной программе ImageJ. Распределениея АХЭ в ЗЛЯл у каждого животного исследовали на 10 срезах. Исследования проведены с использованием оборудования «Ресурсного центра молекулярных и клеточных технологий» Санкт-Петербургского государственного университета (РЦ РМиКТ СПбГУ). Результаты исследования. У всех котят наибольший уровень активности АХЭ наблюдался в ЗЛЯм и наружном коленчатом теле, а ЗЛЯл в целом было окрашено слабо. При этом у 2-недельных животных в ЗЛЯл выявлялись шаровидные локусы с более интенсивно окрашенным нейропилем (рисунок, а, в). Эти локусы лучше выражены на срезах стереотаксического уровня Размер выявленных локусов с высоким содержанием АХЭ в ЗЛЯл составил 200- 350 мкм - вдоль длинной оси и 250-350 мкм - вдоль короткой оси; расстояние между центрами локусов составило 500-825 мкм. Важно отметить, что на всех срезах каудального уровня A3,0у всех животных всегда выявляется равное количество локусов с высоким содержанием АХЭ [3, 4]. На ростральных уровнях таламуса эти локусы меняют свою форму: некоторые сливаются друг с другом, другие разделяются на более мелкие; при этом теряется их строгая упорядоченность. Контрастирование изображений позволяет увидеть, что в ЗЛЯм также присутствуют локусы с более интенсивно окрашенным нейропилем; они расположены напротив соответствующих локусов в ЗЛЯл. Локусы с высоким содержанием АХЭ в ЗЛЯл и ЗЛЯм расположены напротив друг друга (см. рисунок, б). У животных в возрасте 14 нед ядро ЗЛЯл имеет однородную слабую окраску и не содержит локусов с отличающимся от среднего по ядру уровнем активности АХЭ (см. рисунок, в). Обсуждение полученных данных. В данной работе мы обнаружили в ЗЛЯл систему упорядоченно расположенных локусов с высоким содержанием АХЭ. До этого подобное неравномерное распределение АХЭ было выявлено в других зрительных структурах: ЗЛЯм таламуса и передних холмиках крыши среднего мозга [5]. Однако эти структуры сами по себе характеризуются высоким содержанием АХЭ; тогда как содержание АХЭ в ЗЛЯл у взрослых кошек [3] и подростков (как мы показали в этой работе) низкое. У 2-недельных котят локусы с высоким содержанием АХЭ расположены в ЗЛЯм и ЗЛЯл напротив друг друга. Принимая во внимание тот факт, что ЗЛЯм получает основные проекции от передних холмиков [5], можно предположить, что АХЭ-локусы в ЗЛЯл также маркируют зоны, получающие проекции от передних холмиков. Это предположение подкрепляется данными исследований, в которых в наиболее латеральной части ЗЛЯл на границе с подушкой были выявлены меченые нейроны после введения антероградного трейсера в передние холмики крыши среднего мозга [1]. Нейроны ЗЛЯл, посылающие афферентные волокна в зрительную кору, организованы кластерным образом [2]; более того, подобная кластеризация показана также и для нейронов, получающих ретинальные, стволовые и корковые проекции [1, 4, 6]. Таким образом, как следует из сказанного выше, во-первых, ЗЛЯл можно считать модульной структурой, во-вторых, вероятным кандидатом на роль молекулярной основы этой модульности могут быть локусы с высоким содержанием АХЭ. Работа поддержана грантом ОФФМ. Коллектив авторов выражает признательность проф. R. Veh (Institut für Anatomie der Charité, Humboldt-Universität Berlin, Germany) за помощь при постановке гистохимической реакции выявления ацетилхолинэстеразы. Авторы благодарят Н. И. Никитину, Н. И. Соколову и О. П. Казину за помощь в обработке гистологического материала и работе с животными.

作者简介

N. Merkuliyeva

RAS I. P.Pavlov Institute of Physiology

Email: mer-natalia@yandex.ru
Laboratory of Neuromorphology

A. Mikhalkin

RAS I. P.Pavlov Institute of Physiology

Email: michalkin@mail.ru
Laboratory of Neuromorphology

A. Veshchitskiy

RAS I. P.Pavlov Institute of Physiology

Email: veschickiyalex@mail.ru
Laboratory of Neuromorphology

参考

补充文件