MORPHO-FUNCTIONAL CHARACTERISTIC OF THE THYROID GLAND AFTER ADMINISTRATION OF COPPER NANOPARTICLES

全文:

Уникальные свойства препаратов наночастиц меди и её соединений определяют их широкое применение. В последние годы получили распространение исследования, обосновывающие использование медьсодержащих наноматериалов при лучевой терапии рака [21]; в качестве контрастного вещества для высокого разрешения магнитнорезонансной томографии новообразований, тромбов и т. д. [22]; при позитронно-эмиссионной томографии [23]; в качестве бактерицидных препаратов [24]; при лечении элементозов [17]; при производстве перевязочных материалов [19] и др. Применение наноматериалов, содержащих медь, способно привести к поступлению дополнительного количества этого металла в организм и сопровождаться дисбалансом элемента. Описаны результаты морфометрических исследований щитовидной железы [10, 11] а также действие дисбаланса микроэлемента меди, проявляющееся признаками гипертиреоза [1, 20]. Показана тесная связь ряда заболеваний щитовидной железы с содержанием меди в крови [14]. Однако детального морфологического исследования щитовидной железы при воздействии данной категории наночастиц не проводилось. В связи с этим целью настоящего исследования являлось изучение действия наночастиц меди на морфофункциональные характеристики щитовидной железы крыс. Материал и методы. Исследования выполнены в рамках работ по разработке новых препаратов микроэлементов на основе наночастиц меди и проведены на белых крысах-самцах линии Вистар массой 150-180 г, которым внутримышечно в течение 90 сут вводили лиозоли наночастиц меди с периодичностью 1 раз в неделю в дозе 2,0 мг/ кг массы животного. Наночастицы меди получали методом высокотемпературной конденсации с последующей модификацией кислородом на установке Миген-3 (ИХФ РАН им. Н. Н. Семенова, Россия). Средний размер частиц составляет 103,0±2,0 нм; кристаллической меди в ядре частиц содержится 96±4%, оксида меди - 4,0±0,4%; толщина оксидной пленки на поверхности наночастиц - 6 нм. Нанопорошок меди диспергировали в изотоническом растворе (0,9% NaCl) на ультразвуковом диспергаторе УЗДН-2Т (Укрприбор, Украина), в режиме: 3-кратное диспергирование по 1 мин с перерывом 3 мин. Материал для исследования структурнофункционального состояния щитовидной железы брали на 7-е сутки после 1-, 2-, 3-, 4-йи 12-й инъекции (по 3 животных на каждую временную точку). Крысам контрольной группы в одни и те же сроки и в равном объёме вводили дистиллированную воду. Экспериментальные исследования на животных проводили в соответствии с инструкциями, рекомендуемыми Российским Регламентом (1987 г.) и «The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press Washington, D. C. 1996)». Для световой микроскопии щитовидную железу фиксировали в 10% нейтральном формалине в течение 1 сут. После стандартной гистологической проводки материал заливали в парафин. Срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином Майера - эозином. С помощью окулярного микрометра на поперечных срезах долей щитовидной железы во всех их зонах измеряли величину фолликулов, высоту тироцитов, диаметр их ядер, определяли объем последних. На срединных срезах органа с помощью точечной тестовой системы определяли относительную объемную плотность (V) мелких, средних размеров и крупных кистоподобных фолликулов по формуле: m V= ×100%, n где m - число точек, приходящееся на конкретный вид фолликула, n - число всех точек системы [2]. Подсчет проводили не менее чем в 100 случайно выбранных полях зрения на условной площади среза (2500 мкм2). Критерием классификации фолликулов являлся их диаметр: мелкие - менее 40 мкм, средние - 40-60 мкм, кистоподобные - более 60 мкм. При расчете диаметра ядер различной формы (шарообразное, эллипсовидное) использовали общепринятые формулы [9]. Парафолликулярные клетки выявляли путем импрегнации нитратом серебра по Гримелиусу. Иммуноцитотохимические исследования [6] проводили с использованием моноклональных антител к белку Ki-67 Antigen и системы визуализации (BioGenex, США) по протоколам фирмы-производителя. Готовность клеток к апоптозу оценивали по экспрессии каспазы-3, подсчитывая иммунопозитивные клетки среди 1000 и выражали в промилле. В случайно выбранных полях зрения также подсчитывали митотически делящиеся клетки. Элементный состав биосубстратов (скелетная мускулатура, костная ткань, внутренние органы) изучали с использованием атомно-эмиссионной и масс-спектрометрии (АЭС-ИСП и МС-ИСП) в испытательной лаборатории АНО «Центр биотической медицины» (Москва). Озоление биосубстратов проводили с использованием микроволновой системы разложения MD-2000 (США). Оценку содержания элементов в полученной золе осуществляли с использованием массспектрометра Elan 9000 (PerkinElmer, США) и атомноэмиссионного спектрометра Optima 2000V (PerkinElmer, США). На основании данных о содержании химических элементов в тканях и органах тела рассчитывали совокупную массу элементов (пул элемента) в организме крыс. Статистическую обработку полученных данных проводили c использованием пакета программ Statistica 5,5 forWindows и программного пакета MSExcel 2000. О значимости различий судили по величине t-критерия Стьюдента и считали значимыми при P<0,05. Результаты исследования. Форма фолликулов у животных в контрольной группе - круглая или неправильная многоугольная. Количество фолликулов (здесь и далее на условной единице площади) составило 41±4. В органе преобладают средней величины и мелкие фолликулы (рис. 1). Отношение количества мелких и средней величины фолликулов к кистоподобным - 6:1. Высота тироцитов - 7±0,5 мкм, объем их ядер - 35,7±0,3 мкм3 (рис. 2). Исследование щитовидной железы на 7-е сутки после 1-кратного внутримышечного введения наночастиц не обнаружило существенных структурных отличий от таковой у контрольных животных. В щитовидной железе у крыс этих групп преобладают малые и среднего размера фолликулы. Объем ядер и высота тироцитов увеличиваются. Относительное содержание экспрессирующих каспазу-3 парафолликулярных клеток возрастает до 3,80±0,20‰ по сравнению с контролем (0,50±0,005‰). Через 7 сут после 2-кратного внутримышечного введения наночастиц по сравнению с контролем увеличивается относительная объемная плотность кистоподобных фолликулов и умеренно уменьшается - мелких и средних по величине фолликулов (см. рис. 1). Отношение количества мелких и средних фолликулов к крупным кистоподобным - 4:1. Число фолликулов убывает до 35,0±2,0. Уменьшаются высота тироцитов и объём их ядер (см. рис. 2), что свидетельствует о снижении их функциональной активности. Среди парафолликулярных клеток чаще выявляются клетки с признаками апоптоза. Через 7 сут после 3-йи 4-й инъекций наночастиц обнаруживается также по сравнению с контролем увеличение относительной объемной плотности кистоподобных и уменьшение - мелких и средних по величине фолликулов (рис. 3). Отношение количества мелких и средних фолликулов к крупным кистоподобным - 3:1. Уменьшаются количество фолликулов до 31,0±1,0, высота тироцитов и объем их ядер (см. рис. 1, 2). Среди парафолликулярных клеток чаще, чем после 2-кратного введения наночастиц меди, выявляются клетки с признаками апоптоза. Показатель экспрессии каспазы-3 на 7-е сутки после 4-й инъекции увеличивается до 4,2±0,3‰ по сравнению с контролем (1,0±0,04‰). Через 7 сут после 12-й инъекции наночастиц исчезают кистоподобные фолликулы. Число фолликулов увеличивается до 65±6. Обнаруживается небольшое количество средних по размеру фолликулов, преобладают мелкие, лишенные коллоида фолликулы, образующиеся в результате активной пролиферации тироцитов, что подтверждается увеличением среди них количества митотически делящихся до 6,8±0,3‰ по сравнению с контролем, в котором их - 3,60±0,20‰, и возрастанием числа клеток, экспрессирующих Ki-67 до 12,6±0,3‰ (в контроле 5,40±0,20‰). Происходит активизация апоптоза среди парафолликулярных клеток (рис. 4). Показатель экспрессии каспазы-3 увеличивается до 5,9±0,4‰ по сравнению с контролем, где он составляет 0,9±0,06‰. В щитовидной железе на 7-е сутки после 1-, 2-, 3-и 4-кратных внутримышечных введений наночастиц выявлена тенденция к увеличению числа крупных кистоподобных фолликулов, уменьшению средней высоты тироцитов и объема их ядер, что может свидетельствовать о возможном снижении выработки ими гормонов. Кроме того, по мере увеличения числа введений наночастиц возрастает готовность клеток к апоптозу и в первую очередь среди парафолликулярных. После 12 внутримышечных введений наночастиц меди на 91-е сутки опыта в гиперплазированной щитовидной железе обнаруживаются мелкие фолликулы, выстланные столбчатым эпителием, в которых коллоид отсутствует или содержится в небольшом количестве, увеличивается количество митотически делящихся тироцитов. На этом фоне параллельно с количеством инъекций растёт число клеток, экспрессирующих каспазу-3. Эти процессы развиваются на фоне значительного снижения пула йода в организме животных с 94×10-5 на 7-е сутки до 50×10-5 ммоль/г после 91 сут опыта. Обсуждение полученных данных. Морфологические данные свидетельствуют о зобогенном эффекте наночастиц меди. Следует отметить, что реакция органа имеет дозозависимый характер. В частности, 1-кратное поступление наночастиц меди (доза 2 мг/кг) в организм провоцирует функциональную активацию органа, судя по увеличению объема ядер и высоты тироцитов. Дальнейшая нагрузка организма наночастицами меди (суммарная доза 8 мг/кг) приводит к снижению функциональной активности железы, о чём свидетельствуют уменьшающиеся высота тироцитов и объём их ядер, отмечается увеличение числа крупных кистоподобных на фоне снижения - мелких и средней величины фолликулов, что свидетельствует о нарушении фолликулогенеза [4]. Эти изменения могут свидетельствовать о снижении выработки ими тиреоидных гормонов. Хроническое поступление наночастиц меди (в течение 3 мес суммарная доза 24 мг/кг) приводит к увеличению числа мелких фолликулов в результате пролиферации тироцитов, что можно расценивать как активизацию процессов фолликулогенеза. Возрастание количества мелких фолликулов с усиленными пролиферативными возможностями и повышенным метаболизмом [15] может трактоваться как неспецифическая адаптация органа к хроническим воздействиям независимо от их этиологии [5]. В то же время, в железе среди парафолликулярных клеток выявлена апоптотическая доминанта, которая, вероятно, и является причиной нарушения местного гомеостаза, связанного с уменьшением выработки С-клетками соматостатина и обнаруженной в связи с этим повышенной пролиферацией тироцитов. Возможно, нарушением выработки тиреокальцитонина, усилением процессов резорбции костной ткани и повышением в крови концентрации кальция [16] можно объяснить выявленное увеличение более чем в 5 раз содержания кальция в мышечной ткани у подопытных животных по сравнению с контрольными (с 1,06 до 6,09 мг/г). Механизмы токсического действия наночастиц зависят от особенностей клеток, размера наночастиц и других факторов. Предполагается, что наноматериалы индуцируют апоптоз за счет накопления активных форм кислорода. Такие исследования проведены на Т-лимфоцитах человека, эмбриональных почечных клетках НЕК293 [12]. В культуре макрофагов RAW 264.7 наблюдается отчетливо выраженный окислительный стресс [25]. Также высказаны предположения о молекулярных механизмах токсичности [13]. В условиях микроэлементоза возникают структурные преобразования щитовидной железы, проявляющиеся десквамацией фолликулярного эпителия, разрастанием соединительной ткани, нарушениями микроциркуляции, дифференциации, изменением тинкториальных свойств коллоида, накоплением тяжелых металлов в органе [3, 7]. Анализируя изменения в щитовидной железе животных, вызванные внутримышечными инъекциями наночастиц меди, можно отметить, что ранее было описано аналогичное действие дисбаланса микроэлемента меди, проявляющееся признаками гипертиреоза [1, 20]. Как ни парадоксально, в проведённом исследовании отмечено значительное снижение содержания меди и йода в организме животных - начиная с 14-х суток неизменно общий пул этих элементов в организме подопытных животных был меньше, чем в контроле. Ввиду высокой токсичности для организма соединений меди эти изменения вполне закономерны: поскольку избыточное поступление этого элемента сопряжено с большей элиминацией с мочой и через пищеварительный тракт [8]. Поэтому динамика морфофункциональных характеристик щитовидной железы оказалась типичной для гипертиреоза, вызванного дефицитом меди. Зобогенный эффект наночастиц меди проявлялся на фоне угнетения обмена йода [26]. Полученные сведения о разном влиянии на запрограммированную гибель с ее усилением среди парафолликулярных клеток и угнетением среди тироцитов в разных экспериментальных группах могут указывать на модулирующее (т. е. как индуцирующее, так и ингибирующее) влияние меди на апоптоз [18]. Таким образом, в щитовидной железе после 1-, 2-, 3-и 4-кратного внутримышечного введения наночастиц меди выявлена тенденция к снижению её функциональной активности и выработки тиреоидных гормонов. Кроме того, по мере увеличения числа введений увеличивается готовность клеток к апоптозу и, в первую очередь, среди парафолликулярных. Хроническое поступление наночастиц меди приводит к гиперплазии щитовидной железы с признаками компенсаторных процессов, что обусловливает зобогенный эффект.

作者简介

V. Polyakova

Orenburg State University

Department of Pathological Anatomy

Ye. Sizova

Orenburg State University; All-Russian Research Institute of Beef Cattle Breeding

Email: Sizova.L78@yandex.ru
Department of General Biology; Laboratory of Agroecology of Technogenic Nanomaterials

S. Miroshnikov

Orenburg State University; All-Russian Research Institute of Beef Cattle Breeding

Email: vniims.or@mail.ru
Institute of Bioelementology; Laboratory of Mineral Nutrition

S. Notova

Orenburg State University

Department of Biochemistry and Molecular Biology

S. Zavaleyeva

Orenburg State University

Department of General Biology

参考

补充文件