EPIDERMAL THICKNESS AND KERATINOCYTE PROLIFERATION AFTER CUTANEOUS APPLICATION OF VITAMIN D 3

全文:

Витамин D имеет две формы — витамин D2 (эргокальциферол) и витамин D3 (холекальциферол); к их активному метаболиту (кальцитриолу) у клеток многих тканей и органов есть ядерные рецепторы [6]. Кальцитриол рассматривается в качестве аналога стероидных гормонов [5], способного генерировать биологические реакции в тканях-мишенях, в том числе в коже, оказывая влияние на морфогенез её структурных компонентов и, прежде всего, — кератиноцитов [6]. Морфологические аспекты дерматотропных эффектов витамина D3 изучали в основном на примере синтетических аналогов его активных метаболитов — кальципотриола (дайвонекс, дайвобет), такальцитола (куратодерм); при этом авторы, как правило, отмечают, что эти соединения тормозят пролиферацию кератиноцитов и ускоряют их дифференцировку [11, 13]. Однако встречаются сообщения, что производные витамина D3 усиливают пролиферацию кератиноцитов [10]. Морфологические проявления воздействия на кожу в условиях наружного нанесения самого холекальциферола, а не его активных метаболитов, в литературе практически не освещены. Сведений о том, являются ли дерматотропные фармакологические эффекты воздействия витамина D3 и его активных метаболитов пролонгированными, и если да, то как долго после окончания явления этих эффектов, мы также не встретили. В связи с изложенным представляется актуальным экспериментальное изучение морфогенетических процессов, происходящих в эпидермисе в условиях накожного воздействия витамина D3 и длительности существования достигнутых при этом фармакологических эффектов. Цель настоящего исследования — изучение особенностей строения эпидермиса и его толщины, а также пролиферативной активности кератиноцитов в условиях накожного нанесения композиции, содержащей витамин D3. Материал и методы. Исследование проводили на самках и самцах половозрелых беспородных крыс в возрасте 1,5–2 мес, полученных из филиала ГУ НЦ биомедицинских технологий РАМН «Столбовая» и выдержанных в карантине в течение 2 нед. Опыты поставлены в условиях вивария ЗАО «Ретиноиды» в соответствии с «Правилами проведения работ с использолванием экспериментальных животных» (приложение к приказу № 755 от 12.08.1977 г. МЗ СССР). Все параметры содержания животных (температура в помещении, влажность, освещённость, корм, вода и др.) были стандартизированы и соответствовали санитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментальнобиологических клиник (вивариев). Животные были разделены на 3 группы по 24 особи в каждой: 1-я контрольная группа — интактные животные; 2-я контрольная группа — животные, получавшие аппликации эмульсионной (эмульсия вазелинового масла в воде) основы; 3-я группа — экспериментальные животные, получавшие аппликации композиции на той же основе. Аппликации проводили на предварительно выстриженный участок кожи межлопаточной области спины размером 2×2 см в вечерние часы на протяжении 14 сут (без повторной стрижки); количество ежедневно наносимой композиции составило 0,125 мг/см2 (0,5 г на животное в сутки, в пересчёте на чистый витамин D3 — 125 мг/кг массы тела). Образцы кожи из зоны аппликаций брали через 1 и 30 сут после окончания аппликаций. Эвтаназию крыс осуществляли парами хлороформа. Образцы кожи фиксировали в расправленном состоянии в 10% забуференном формалине (pH 7,4). Проводку, заливку образцов в парафин и изготовление срезов проводили по стандартным методикам. Просмотр окрашенных гематоксилином—эозином срезов и морфометрические исследования осуществляли с помощью светового микроскопа Axiostar (Сarl Zeiss, Германия), а также — комплекса цифрового микроскопического Микмед-2-1600-3 (Россия) и свободно распространяемого программного обеспечения Image Tool. Измеряли толщину эпидермиса от базальной мембраны до рогового слоя, а также суммарную толщину базального и шиповатого слоёв. Для изучения пролиферативной активности кератиноцитов использовали антитела к Ki-67 (Clone SP-6, Cell Marque, США). Иммуногистологическое окрашивание осуществляли согласно рекомендациям фирмы-производителя. Экспрессию Ki-67 оценивали, рассчитывая индекс Ki-67 (IKi-67), как долю (%) меченых ядер по отношению к общему числу ядер в базальном и шиповатом слоях в поле зрения микроскопа. Исследовали по одному срезу кожи от каждого животного. Подсчёты делали при об. 100, ок. 15 в 20–23 полях зрения среза. Статистическую обработку проводили с помощью параметрических методов вариационной статистики (вычисление наименьших квадратов разностей и t-критерия Стьюдента) с использованием программного обеспечения Microsoft Excel; статистически значимыми считали результаты с уровнем вероятности не менее 95%. Результаты исследования . Через 1 сут после окончания аппликаций основы в сравнении с эпидермисом интактных животных наблюдается некоторое истончение зернистого и рогового слоёв. При аппликациях композиции с витамином отмечалось неравномерное (более выраженное у самцов) уменьшение толщины клеточного эпидермиса, в основном за счёт базального и шиповатого слоёв (рисунок, а, б). Через 30 сут эпидермис животных, получавших аппликации основы, практически не отличался от такового у интактных животных. У крыс, подвергнутых накожному воздействию композиции с витамином D3, эпидермис выглядел истончённым за счёт всех слоёв клеточного эпидермиса (см. рисунок, в, г); при этом у самок этот эффект был выражен сильнее. Визуальные наблюдения подтверждены данными морфометрического исследования (табл. 1). Эффект при исследовании композиции с витамином D3 является пролонгированным и сохраняется в течение 30 сут после окончания воздействия; при этом он более выражен, чем через 1 сут. Через 30 сут после окончания аппликаций как общая толщина клеточного эпидермиса, так и суммарная толщина его базального и шиповатого слоёв статистически значимо отличаются от показателей в обеих контрольных группах. Зернистый слой эпидермиса через 30 сут после окончания аппликаций в коже животных, подвергнутых воздействию витамина D3, тоньше, чем у интактных животных (1,63 и 5,27 мкм у самок, 7,86 и 9,20 мкм у самцов соответственно), в то время как толщина зернистого слоя у крыс, получавших аппликации мазевой основы, через 30 сут после их окончания почти не отличалась от таковой у интактных животных (4,44 и 5,27 мкм у самок, 9,26 и 9,20 мкм у самцов соответственно). При изучении срезов, окрашенных с помощью моноклональных антител к маркёру пролиферации Ki-67, обнаружено, что у интактных животных меченые ядра кератиноцитов располагаются только в базальном слое интерфолликулярного эпидермиса, группами по 2–4 клетки. Эпидермис животных 2-й контрольной группы визуально не отличался от эпидермиса интактных животных по интенсивности мечения кератиноцитов антителами. Ежедневные в течение 2 нед накожные аппликации композиции с витамином D3 привели к снижению числа кератиноцитов, экспрессирующих Кi-67 (см. рисунок, д–з). Подсчёты подтвердили эти наблюдения (табл. 2). Через 30 сут после прекращения аппликаций композиции с витамином D3 количество меченых ядер в интерфолликулярном эпидермисе у крыс продолжает оставаться сниженным (см. рисунок, ж, з, табл. 2); у самок этот эффект выражен несколько сильнее. Таким образом, ежедневные, в течение 14 сут аппликации композиции с витамином D3 на кожу межлопаточной области спины у крыс приводят к снижению экспрессии Ki-67 кератиноцитами интерфолликулярного эпидермиса, что проявляется уменьшением соответствующего индекса и свидетельствует о падении уровня их пролиферативной активности. Через 30 сут после окончания нанесения композиции с витамином D3 индекс Ki-67 в эпидермисе значимо меньше, чем у контрольных животных обоего пола. Обсуждение полученных данных . Проведённое исследование выявило, что строение интерфолликулярного эпидермиса кожи интактных крыс соответствует известной видовой норме с учётом половых особенностей [2]. Ежедневные в течение 14 сут накожные аппликации основы композиции вызывают у крыс уменьшение толщины клеточного эпидермиса (до рогового слоя), но не суммарной толщины его базального и шиповатого слоёв, что, возможно, связано с механическим воздействием шпателя на верхние слои кожи, способствующим десквамации части роговых чешуек и зернистых кератиноцитов, а также — с вяжущим, дубящим воздействием на ткани этилового спирта, входящего в состав основы композиции. Аппликации на кожу композиции с витамином D3 приводят к статистически значимому истончению интерфолликулярного эпидермиса и снижению в нём числа кератиноцитов, экспрессирующих Ki-67; ранее было показано, что эти показатели друг с другом коррелируют [3]. Таким образом, витамин D3 в условиях накожного воздействия модифицирует морфогенетические процессы в эпидермисе, уменьшая пролиферативную активность кератиноцитов. Объяснить возникновение этих эффектов в результате накожного нанесения нативного витамина D3 можно, учитывая появившиеся в последние годы сообщения, что кальцитриол может образовываться из холекальциферола непосредственно в коже с участием дендритных клеток и Т-лимфоцитов [9, 12] и кератиноцитов [8]. Локально концентрируясь, этот метаболит, подобно стероидным гормонам, воздействует на эпидермис, приводя к его истончению в результате снижения пролиферативной активности кератиноцитов. Ферментные системы клеток кожи, обеспечивающие превращение витамина D с образованием кальцитриола, работают и в отношении витамина D2, хотя и менее эффективно [12]. Сохранность и даже некоторое усиление фармакологического эффекта композиции с витамином D3, выявленные через 30 сут после окончания аппликаций, могут быть связаны с воздействием кальцитриола на иммунокомпетентные клетки и выработку ими цитокинов, способных влиять на пролиферацию, дифференцировку и функциональную активность клеток-мишеней с формированием паракринных цитокиновых сетей [4]. Так, известно, что кальцитриол вызывает миграцию Т-лимфоцитов по направлению к эпидермису (эпидермотропизм) [9, 12], возможно, с целью уничтожения дефектных клеток, образующихся при воздействии повреждающих факторов, а также ограничивает антиген-представляющую функцию клеток Лангерганса, синтезирующих факторы, регулирующие пролиферацию кератиноцитов [7]. В связи с обсуждаемым вопросом следует упомянуть также концепцию, согласно которой лимфоциты, как наиболее чувствительные акцепторы различной информации об изменениях внешней и внутренней среды, способны оказывать воздействие на морфогенетические процессы в тканях, в том числе на обеспечивающие физиологическую регенерацию [1]. Таким образом, витамин D3 в составе мазевой композиции при ежедневном в течение 14 сут нанесении на неповреждённую, лишённую волосяного покрова кожу крыс вызывает уменьшение толщины клеточного эпидермиса, ингибируя пролиферативную активность кератиноцитов. Эффект является пролонгированным, сохраняясь по меньшей мере в течение 30 сут после окончания аппликаций.

作者简介

S. Zhuchkov

Medical Institute of Oryol State University

Email: orelhistret@orl.ru

T. Belousova

Medical Institute of Oryol State University

Email: belousova@retinoids.ru

V. Nozdrin

«Retinoids» Pharmaceutical Scientific-Production Enterprise

Email: science@retinoids.ru

参考

补充文件