Cellular correction of radiation damage in the experiment

全文:

Актуальность

Рост военной напряженности в разных регионах земного шара требует разработки новых методов лечения лучевой болезни. Лучевое поражение также формирует клинические проблемы, определяющие важность практического применения фундаментальных гистологических закономерностей клеточной дифференцировки, межклеточных интеграций, дифферонной тканевой организации, для восстановления нарушенного гистофизиологического гомеостаза. Ключевая роль в поддержании пулов дифференцирующихся и специализированных клеток отводится клеткам камбиального резерва и их микроокружению. Стволовые клетки также являются одним из основных инструментов регенеративной медицины. В тоже время их биологические эффекты рассматриваются как перспективные для применения в военной медицине [1]. Вышеперечисленное основания определили цель настоящего обзора.

Цель – оценить достижения и возможность применения стволовых клеток и их внеклеточных везикул при радиационном поражении.

Материалы и методы

Проведен детальный анализ литературных данных об эффективности трансплантации стволовых клеток при радиационном поражении в эксперименте. Оценка исследований на соответствие критериям включения проводилась в три этапа: оценка заголовка, аннотации, полного текста статьи. Рассматривались только опубликованные работы, в анализ не включали тезисы и материалы конференций. Два исследователя независимо друг от друга осуществляли поиск публикаций в электронных базах данных (PubMed, Scopus, «КиберЛенинка», eLIBRARY.RU), опубликованных с января 2002 по апрель 2024 г., по ключевым словам, связанных с понятиями «лучевая болезнь» и «регенеративная медицина». Публикации, идентифицированные через поиск в базах данных, составили 562 рукописи. В анализ были включены 6 русскоязычных и 114 иностранных публикаций. Критерием исключения стали трансплантация тканей, без выделения стволовых клеток или внеклеточных везикул, такая как трансплантация красного костного мозга, включающего в себя как гемопоэтические стволовые клетки, так и мезенхимальные и клетки-предшественницы.

Результаты исследований

Исследования Н. В. Калмыковой и С.А. Александровой [2] и В.И. Легезы с соавт [3] являются наиболее близкими к нашему исследованию обзорами литературы. Однако исследование Н. В. Калмыковой концентрируется исключительно на мезенхимальных стволовых клетках и не включает в себя информацию по внеклеточным везикулам из-за давности литературного обзора более 9 лет назад. Главным преимуществом работы является системный подход, который позволяет систематизировать клеточные эффекты мезенхимальных стволовых клеток по основным системам человеческого организма [2]. Более свежее исследование В. И. Легезы фокусируется на костномозговой форме острой лучевой болезни и историческом аспекте трансплантации гемопоэтических стволовых клеток [3].

В нашем исследовании мы рассматриваем применение различных видов стволовых клеток и их внеклеточных везикул. Медико-биологические эффекты трансплантации структурированы, во-первых, с учетом системного подхода, во-вторых, соответственно органам-мишеням и патогенетическим механизмам, обеспечивающих формирование костномозговой, кишечной и церебральной форм острой лучевой болезни (таблицы 1,2,3).

Острая лучевая болезнь вызывает полиорганную недостаточность. Аплазия костного мозга может сочетаться с желудочно-кишечным синдромом, ожогами кожи, последствиями радиолиза в мускулатуре и легких и (или) поражением центральной нервной системы и другими состояниями в зависимости от таких характеристик облучения как: энергия, доза, мощность дозы и геометрия воздействия. Для коррекции этих нарушений используются стволовые клетки, способные к пролиферации и дифференцировке по заданному направлению, полученные из неповрежденной (или менее) поврежденной части тела или из аллогенного источника [4] (рис 1).

 

Рисунок 1. Стволовые клетки при лечении радиационного поражения

Figure 1. Stem cells in the treatment of radiation damage

 

Однако, как показывают исследования, наиболее часто регенераторный эффект клеточной терапии достигается за счет паракринной активности клеток трансплантата, опосредованной клеточными везиклами. Внеклеточные везикулы обычно делят на 3 подгруппы в зависимости от их биогенеза; а) экзосомы диаметром 40–150 нм; б) микровезикулы диаметром 150-1000 нм и в) апоптотические тельца [5]. Поскольку термины «экзосомы» и «внеклеточные везикулы» или «микровезикулы» как минимум до 2016 года часто использовались как синонимы [6], то в нашем литературном обзоре будет использован термин «внеклеточные везикулы», обобщающий эти структуры.

Эффекты внеклеточных везикул включают в себя не только паракринное действие через внеклеточное пространство, но и дистантное, при помощи системы кровообращения. Интернализация внеклеточных везикул клетками-реципиентами происходит либо посредством эндоцитоза, реже посредством слияния с плазматической мембраной [7].

Содержимое внеклеточных везикул включает белки, липиды, митохондрии и нуклеиновые кислоты, которые обеспечивают передачу сигналов от клетки к клетке [8]. От внеклеточных протеаз и нуклеаз содержимое экзосом защищает мембрана [9].

Биораспределение внеклеточных везикул связано с путем их введения. Внутрибрюшинные и подкожные инъекции приводят к значительному снижению накопления внеклеточных везикул в печени, в отличие от внутривенных (внутривенно (в/в): 60±3,9%; внутрибрюшинно (и/п): 35±4,2%; подкожно (п/к): 30±4,5%) и селезенке (в/в: 12±3,6%; и/п: 5±1,0%; п/к: 2±0,3%;). При внутрибрюшинном и подкожном путях введения внеклеточных везикул отмечается повышенное накопление в поджелудочной железе (в/в: 2,6±%; и/п: 17±2,9%; п/к: 10±0,5%) и желудочно-кишечном тракте (в/в: 16±1,8%; внутрибрюшинно: 36±1,7%; п/к: 41±3,9%) [10].

Внеклеточные везикулы могут вызвать не только позитивный, но и негативный эффект Внеклеточные везикулы, секретируемые стареющими клетками, могут способствовать онкогенезу и возрастным патологиям [11]. Это может быть потенциальным механизмом, объясняющим высокую заболеваемость раком, у выживших после облучения.

Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК). Трансплантация аллогенных ГСК является эталонным методом лечения гемопоэтического синдрома при острой лучевой болезни [12]. Аллотрансплантация клеток красного костного мозга (ККМ) через 10-15 минут после получения смертельной дозы облучения позволяет снизить смертность мышей на 30%, морских свинок на 50%. К сожалению трансплантация ККМ гетерологичных животных, обладает меньшим терапевтическим эффектом [13, 14], что вызвано реакцией «трансплантат против хозяина», развивающейся почти у 40% реципиентов [15]. Это определяет необходимость в постоянной иммуносупрессии. Лечение аутологичными ГСК могло бы решить эту проблему. Однако после радиационного поражения возникает опасность развития миелодисплазии. Последнее снижает актуальность использования аутологичных ГСК для терапии острой лучевой болезни.

Вместе с тем недостаточность ККМ не являются единственной причиной смерти при лучевой болезни. Высокие дозы радиации могут привести к смерти от энтерита, пневмонита и отека головного мозга. Эти формы лучевой болезни не поддаются лечению трансплантацией ГСК [16, 17]. Поэтому, доступные в настоящее время методы лечения облучения более 1 Гр являются паллиативными.

Поскольку клетки-предшественницы миелопоэза способны дифференцироваться только по направлению к гранулоцитам, эритроцитам, моноцитам и дендритным клеткам, исключая лимфоциты, то их можно рассматривать как относительно безопасный способ восстановления кроветворения при лучевой болезни с низкой вероятностью развития реакции «трансплантат против хозяина». V.K. Singh с соавт. трансплантировали миелоидные клетки-предшественницы (КОЕ-миелопоэза), полученные от мышей аллогенных линий различным линиям мышей после воздействия смертельной дозы облучения от 9 до 15 Гр [18]. Трансплантация аллогенных миелоидных клеток-предшественниц мышам в течение 7 дней после воздействия смертельной дозы радиации (гамма- и рентгеновские лучи от 9 до 15 Гр) обеспечивала значительный рост выживаемости (Таблица 1). Радиопротекторное действие было связано с регенерацией энтероцитов слизистой оболочки кишечника, предотвращением проникновения кишечной микрофлоры в кровь и восстановлением кроветворной системы [19].

В литературе есть несколько сообщений о том, что стволовые клетки и клетки-предшественницы могут быть мобилизованы с использованием сукцинат альфа-токоферола и собраны из донорской крови. В эксперименте переливание донорской крови мышей, получавших сукцинат альфа-токоферола, привело к снижению смертности животных. Поскольку трансплантация ГСК не проводилась, то этот эффект очевидно бы вызван находящимися в крови мобилизованными ГСК [20]. Эту стратегию можно использовать в условиях массового поражения радиацией, когда поиск доноров затруднителен, что актуально для лиц, с высоким риском воздействия высоких доз ионизирующего излучения (военнослужащих, медицинского персонала) [21]. Его аналог, отличающийся наличием трех транс-двойных связей в углеводородном хвосте, токотриенол показал наибольшую эффективность по сравнению с токоферолами Его профилактического введение в дозах 37,5 и 75 мг/кг человекообразным обезьянам после воздействия дозы облучения от 5,8 до 6,5 Гр привело к значительному снижению выраженности нейтропении и тромбоцитопении [22]. Это делает его перспективным средством, учитывая то что на сегодняшний день у нас нет ни одного радиопротектора, одобренного FDA США, который можно было бы использовать для защиты людей с высоким риском летального воздействия радиации в результате ядерных/радиологических аварий и преднамеренной террористической деятельности [23].

Мультипотентные мезенхимальные стромальные (стволовые) клетки (МСК). МСК ККМ относительно устойчивы к ионизирующей радиации и сохраняют свой потенциал дифференцировки даже при воздействии высоких доз [24, 25], даже при облучении в дозах до 12 Гр, не было обнаружено признаков митохондриального стресса или апоптоза [26].

МСК, полученные из жировой ткани человека, подавляют передачу сигналов TNF-α в легких, при локальном облучении половины грудной клетки дозой 15 Гр у крыс Sprague-Dawley, и предотвращают приводящий к развитию легочного фиброза эпителиально-мезенхимальный переход в миофибробласты пораженных радиацией альвеолярных эпителиальных клеток II типа [27]. МСК пуповины человека могут оказывать терапевтический эффект при радиационно-индуцированном повреждении легких (RILI), секретируя цитокины и тем самым ингибируя миофибробластную дифференцировку фибробластов легких человека [28]. Несмотря на то, что исследования показали, что МСК способны улучшать функциональные показатели легких у пациентов с легочным фиброзом, однако, они не могут элиминировать фибробласты, деградировать нежелательный межклеточный матрикс или обеспечить регенерацию альвеолярного эпителия [29].

Трансплантация МСК костномозгового происхождения значительно улучшает восстановление кроветворения и предотвращают смертность мышей, подвергшихся воздействию ионизирующего излучения в дозе 7,0 Гр [30]. Аутотрансплантация приматам на 1 день после тотального облучения тела в дозе 8 Гр, клеточного продукта из МСК и клеток лимфоидной и мегакариоцитарной линий, мононуклеарных клеток (МНК), гранулоцитарно-макрофагальных колониеобразующих единиц (КОЕ-ГМ), бурстобразующих единиц гемопоеза (БОЕ-Э) и клеток обеспечивающих поддержание кроветворения в длительной культуре костного мозга (КИДК, Long-term Culture Initiating Cell, LTC-IC), сформированного в результате 7-дневной экспансии клеток красного костного мозга ex vivo в присутствии фактора стволовых клеток, лиганда FMS-подобной тирозинкиназы 3 (Flt-3), тромбопоэтина и интерлейкина-3 (IL-3) и IL-6, сокращает период и тяжесть радиационной панцитопении и ускоряет восстановление лейкоцитов периферической крови после [4]. В дальнейшем МСК и их потомки сохраняются в поперечнополосатой мускулатуре, дерме кожи, кишечнике, красном костном мозге как минимум 82 дня после облучения [31].

Рост жизнеспособности ГСК в присутствии МСК был подтверждён при культивировании in vitro – количество ГСК в присутствии МСК было в 4,9 раза больше чем при изолированном культивировании [32]. Свойство МСК поддерживать кроветворение так же продемонстрирована Fouillard et al. в своем клиническом исследовании [33]. У 8 пациентов с острым миелоидным лейкозом после радиотерпии совместная инфузия МСК с ГСК улучшила приживление ГСК и ускорила восстановление кроветворения. Также в экспериментах на мышах продемонстрировано снижение реакции «трансплантат против хозяина» при совместном введении МСК человека с ГСК [34]. Исследователи, также подчеркивают, что восстановление кроветворения достигается за счет рекрутирования эндогенных стволовых клеток, сами МСК не являются регенеративными по отношению к гемопоезу [16]. МСК способствуют модулированию ниши гемопоэтических стволовых клеток красного костного мозга, что приводит к восстановлению гемопоэза [35]. Кроме того, терапия МСК снижает апоптоз КОЕ гематогенного дифферона [36]. Это связано с тем, что гибель эндогенных ГСК не охватывает все 100% их популяции.

При кишечном синдроме вызванным воздействием облучения всего тела мышей линии C57BL/6, в дозе 10,4 Гр или локальным облучением кишечника более в дозе 16 Гр, через 3,5 дня после облучения, трансплантация МСК, полученных из костного мозга, повышает способность эпителиальных клеток крипт синтезировать ДНК по сравнению с контрольной группой почти в 2 раза, а количество Lgr5-позитивных столбчатых (стволовых) клеток кишечного эпителия в основании крипт возрастает в 10 раз по сравнению с контрольной группой (Таблица 2). Предполагается, что донорские клетки смягчают радиационное повреждение кишечника за счет подавления простагландин E2-зависимого воспаления [37]. K. Zheng с соавт. так же продемонстрирована сохранность гистологического строения системы крипта-ворсинка при аллотрансплантации МСК после локального облучения области живота у крыс в дозе 12 Гр [38]. Трансплантированные ксеногенные МСК из ККМ у мышей после воздействия дозы 10,5 Гр обнаруживаются в участках повреждения кишечника, где отмечается увеличение пролиферации и уменьшение гибели клеток в эпителиальных клетках крипт и восстановление их структурной целостности и функциональной активности [39]. Введение МСК спустя 2 часа после облучения мышей в дозе 14 Гр уменьшало повреждение кишечника и увеличивало количество регенерирующих крипт. Это было связано с значительным увеличением количества стволовых клеток кишечного эпителия (Lgr5+) и их дочерних клеток, включая митотически делящиеся Ki67+ энтероциты и клетки Панета. Так же через 6 часов после облучения в тонкой кишке снижалось количество апоптотических клеток [40]. Предполагается, что саногенный эффект МСК опосредуется через стволовую нишу, которая состоит из мезенхимальной стволовой клетки, эндотелиальной клетки, макрофагов и лимфоцитов и поддерживает рост кишечных стволовых клеток [Lalitha Sarad Yamini Nanduri].

МСК обладают гепатопротекторным действием. В эксперименте при радиационном поражении печени при тотальном облучении тела мышей в дозе 3,2 Гр, и в/в введении 5×10⁶ МСК человека в 0,1 мл наблюдалась нормализация уровня мочевины, снижение уровня АСТ и АЛТ в плазме крови и снижение концентрации малонового альдегида – маркера окислительного стресса [41].

При радиационном повреждении МСК мигрируют в облученные ткани и остаются там до 15 дней [42]. Это может объяснять их положительный эффект при облучении со стороны легких, нервной системы, и эндокринных желез [43].

Так же трансплантация МСК эффективна местном лучевом повреждении, например, при радиационных поражениях кожи. Последние моделировались на экспериментальных свиньях при помощи γ-облучения с использованием источника 60Со в дозе 50 Гр. МСК вводили вводили внутрикожно на 25, 46, 67 дни, а также между 95 и 115 днями после облучения. Иммуногистохимический анализ экспрессии цитокератина показал полное восстановление эпидермиса у 4 из 5 экспериментальных животных. В тоже же время у всей животной группы контроля на 91 сутки после облучения развился некроз поражённого участка кожи [44]. При локальном радиационном повреждении кожи вызванным облучением в дозе 35 Гр, инфузия МСК проведенная спустя 24 часа, уже через неделю может значительно снизить воспаление, радиационно-индуцированный фиброз и контрактуру тканей дефекта, увеличить их толщину за счет синтеза коллагеновых волокон [45]. Вероятно, МСК опосредуют эффект через рецептор 2 фактора некроза опухоли (TNF-R2), стимулирующим IL-10 [46], который обладает мощным противовоспалительным, иммуномодулирующим, иммуносупрессивным эффектом. Также МСК выделяют высокие уровни факторов роста, включая VEGF, который ускоряет заживление ран [47].

Для лечения местных лучевых поражений кожи также может быть использована стромально-васкулярная клеточная фракция жировой ткани. При локальном воздействии рентгеновского излучения у крыс в дозе 110 Гр, однократная трансплантация аутологичных клеток стромальноваскулярной фракции жировой ткани дозе 1×10⁶ клеток вокруг лучевой язвы, после облучения, приводила к достоверному уменьшению средней площади лучевой язвы по сравнению с контрольными животными. К 90-м суткам после облучения происходило полное заживление язв, при этом в контрольной группе значительные по площади язвы наблюдались в течение всего периода наблюдения [48].

Также МСК продемонстрировали свою эффективность по отношению к зрелым клеткам головного мозга. У мышей получивших локальную дозу 10 Гр они приводили к снижению воспаления, и окислительного стресса, улучшению неврологических функций, и сохранности зрелых нейронов (Таблица 3), но не оказывали влияние на показатели нейрогенеза [49]. Вероятно, это связано с нормализацией функции микроглии, а именно снижением её гибели путем пирроптоза [50].

Воздействие радиации в сочетании с травматическим повреждением тканей (комбинированное радиационное поражение) является решающим фактором, угрожающим жизни при ядерных и радиологических авариях [26]. Для комбинированного радиационного поражения характерна выраженная лейкоцитопения, тромбопения, эритропения, анемией [51]. Если группа животных с радиационным поражением (9,25 Гр) характеризуется только 40% смертностью, то группа животных с комбинированным радиационным поражением (9,75 Гр и ожог 15% тела) уже имеет 100% смертность. Трансплантация МСК приводит к увеличению 30-дневной выживаемости у животных с комбинированным радиационным поражением на 30%. Примечательно, что переливание МСК в концентрации 3×10⁶ клеток и более, наоборот, ухудшает выживаемость за счет развивающегося тромбоза.

МСК гетерогенны. Антиген Stro-1 присутствует на клетках колониеобразующей единицы фибробластов в красном костном мозге взрослого человека и потенциально определяет субпопуляцию предшественников МСК [52]. В эксперименте при совместной трансплантации аутологичных МСК с ГСК человека мышам, облученным в дозе 3,5 Гр, жизнеспособность ГСК в крови, селезенке и красном костном мозге мыши была выше, при совместной инфузии с МСК Stro-12+, в отличие от совместной инфузии с МСК Stro-1+. Однако, количество ДНК, МСК, прижившихся в селезенке, мышцах, ККМ, печени и почках, было выше у фенотипа Stro-1+, чем у клеток Stro-12. В головном мозге существенной разницы между этими фенотипами не наблюдалось, тогда как в легких было обнаружено больше ДНК клеток Stro-12, чем Stro-1+ [4].

Регенеративный потенциал МСК очень часто объясняется их способностью к секреции внеклеточных везикул (ВВ-МСК). D. Klein показал, что кондиционированная среда из МСК аорты восстанавливает экспрессию SOD1 и защищает потерю EC в легких мышей RILI [53]. При локальном облучении грудной клетки дозой 15 Гр МСК терапия снижала радиационно-индуцированную экспрессию эндотелиального Mmp2, тем самым нормализуя функцию сосудов и уменьшая повреждение сосудистых структур [54].

Исследования показали, что в ВВ-МСК присутствуют более 150 различных микроРНК, которые регулируют широкий спектр сигнальных путей [55]. Сообщалось о возможности ВВ-МСК восстанавливать повреждения тканей сердца [56], почек [57], легких [58], печени [59], кишечника [60] и хряща [61]. Было показано, что ВВ-МСК обладают противовоспалительным, антиоксидантным, проангиогенным [62], антифиброзным действием [63], смягчают течение инфаркта миокарда [64].

Наличие секретируемых в трансплантате ВВ-МСК достаточно для радиопротективного эффекта [14]. A. Accarie c соавт. показали, что CD81+ ВВ-МСК размером <250 нм и, полученные из ККМ человека, обладают выраженным терапевтическим эффектом при кишечной форме острой лучевой болезни у мышей [60]. В этом исследовании сравнивался эффект внутривенной инъекции 600 мкг ВВ-МСК ККМ через 6, 24 и 48 часов после облучения всего тела 10 Гр. Смерть животных в экспериментальной группе наступала позже на 3,5 дня. Риск мгновенной смерти был снижен на 85%. Было показано, что ВВ-МСК, улучшают обновление эпителия тонкой кишки, стимулируя пролиферацию и ингибируя апоптоз клеток эпителиальных крипт. Через 3 дня после облучения всего тела у мышей, получавших ВВ-МСК, наблюдалось дозозависимое снижение количества апоптотических клеток, увеличение количества клеток Ki67+ в криптах и меньшие изменения архитектуры крипт- ворсинок по сравнению с облученными мышами без лечения. ВВ-МСК, также снижали радиационно-индуцированную проницаемость слизистой оболочки, о чем свидетельствует сохранение иммуноокрашивания клаудином-3 - белка плотных контактов энтероцитов. Поддержание плотных контактов между энтероцитами как в тонком, так и в толстом кишечнике является решающим фактором для снижения смертности от кишечной формы острой лучевой болезни [60].

ВВ-МСК, вводимые после летального полного облучения тела, повышают долгосрочную выживаемость животных. Этот эффект связан с восстановлением клеток гематогенного дифферона, особенно лейкоцитов. Интересно, что ВВ-МСК в большей степени чем сами МСК ускоряют восстановление тромбоцитов после летального облучения животного [65].

Для реализации паракринных эффектов большое значение имеет время введения ВВ-МСК. При введении их сразу после радиационного облучения они вызывают вышеперечисленные радиопротекторные изменения, но при более поздней инъекции – спустя 2 месяца после облучения вовлекаются в развитие фиброза [66]. Также ВВ-МСК могут быть использованы в качестве переносчиков для целевой доставки [67].

Нейральные стволовые клетки (НСК). Не смотря на высокую устойчивость нервной ткани к лучевому воздействию, остается проблема локального облучения головного мозга, одной из основных точек приложения которого является нейрогенез. Через 2 месяца после краниального облучения крыс однократной дозой 10 Гр количество молодых нейронов, возникших в результате постнатального нейрогенеза снижается на 97% [68]. Это вызвано потерей нервных клеток-предшественниц из-за выросшего апоптоза в SGZ зоне нейрогенеза гиппокампа [69]. Также излучение изменяет метаболизм, функцию и дифференцировку выживших нейральных стволовых клеток, что служит существенной предпосылкой для исследования трансплантации ВВ-НСК, направленной на сохранение и пополнение пула эндогенных НСК [70].

M. M. Acharya с соавт., в эксперименте вводили НСК человека линии ENStem-A (hNSCs; EMD Millipore) безтимусным крысам одновременно в правый и левый гиппокамп крысы через 2 дня после однократного краниального облучения в дозе 10 Гр. Через 1 месяц после трансплантации рост выживаемости донорских НСК составил 23%, через 4 месяца - 12%. Клетки активно мигрировали по всей септо-гиппокампальной системе и дифференцировались по направлениям нейронов и астроглии [71]. Если сравнивать когнитивные функции у таких животных, по сравнению с животными, которым не были трансплантированы НСК, то в описываемом случае наблюдается их значительное улучшение. В последующей работе авторы продемонстрировали, что эффект сохранялся до 8 месяцев после облучения [72]. В исследовании на взрослых мышах Belkind et al. [73] использовали два пути введения НСК инъекция внутрь желудочков головного мозга и внутривенный, в двух моделях лучевого поражения головного мозга: локальном мозговом (10 Гр) и всего тела (5 Гр). Трансплантированные НСК, независимо от пути доставки, выживали, в головном мозге в форме нейрональных и глиальных предшественников. Также наблюдалось усиление эндогенного нейрогенеза, вероятно из-за участия трансплантированных клеток в модуляции локального микроокружения.

Эти результаты были аналогичны эксперименту на мышах, проведенному Joo et al. [74], которые подтвердили дифференцировку введенных внутривенно экзогенных НСК мышей в облученном мозге по обоим направлениям. Эти авторы также выявили опосредованную передачей сигналов фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) трансдифференцировку НСК в эндотелиальные клетки головного мозга, которая могла играть роль в восстановлении мозгового кровотока. Кроме того, в мозге мышей, получивших трансплантацию НСК, наблюдалось значительное увеличение нейротрофических факторов, таких как фактор роста нервов (NGF) и фактор роста глиальных клеток (GDNF), что указывает на нейропротекторный потенциал НСК. Также трансплантированные НСК обеспечивали нейропротекторный эффект, тормозя снижение ветвления дендритов и падение плотности шипиков, вызванное радиационным поражением [75].

Эндотелиальные предшественницы (ЭП). Эндотелиальные клетки являются неотъемлемым компонентом ниши ГСК и стволовой клетки энтероцитов – основных мишеней радиационного поражения. Помимо непосредственной потери клеток костного мозга, радиация также вызывает повышенную проницаемость эндотелиальных клеток [76].

Введение эндотелиальных клеток предшественниц смягчает повреждения ККМ при облучении [77]. Мышей C57Bl6 в возрасте от 8 до 10 месяцев подвергали облучению всего тела дозой 7 Гр, трансплантация ЭП путем внутрисосудистой или внутрибрюшинной инъекции способствовала, сохранению клеток-предшественниц кроветворения в красном костном мозге, восстановлению количества циркулирующих лейкоцитов и тромбоцитов после радиационного воздействия. 100% облученных мышей контрольной группы умерли до 30-го дня после облучения, в то время как мыши, получившие трансплантацию эндотелиальных предшественников, дожили до 60-го дня без каких-либо признаков заболеваемости [78].

В исследовании S.O. Piryani авторы изучали, могут ли внеклеточные везикулы ЭП регулировать регенерацию ГСК после ионизирующего излучения [79]. ВВ-ЭП с размером <200 нм и экспрессией CD31, сосудистого эндотелия (VE)-кадгерина были выделены из красного костного мозга мышей C57BL/6 посредством дифференциального центрифугирования. Через 24 часа после облучения всего тела животного дозой 5 Гр (для оценки состояния кроветворения) или 8 Гр (для исследования процента выживших) 1,9 × 10⁹ частиц ВВ-ЭП вводили внутривенно ежедневно в течение четырех дней. Облученные мыши, получившие лечение ВВ-ЭП, показали улучшение клеточного состава ККМ, содержания ГСК и клеток-предшественников, сохранение архитектуры эндотелиальных клеток и увеличили процент выживших животных на 50%.

Очень маленькие эмбриональные стволовые клетки (Very Small Embryonic Like stem cells, VSEL) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки.  Плюрипотентность является уникальной способностью ряда стволовых клеток, но их низкие концентрации накладывают ряд ограничений. VSEL обладают высокой радиационной устойчивостью по сравнению с общей популяцией гемопоэтических стволовых клеток и выдерживают дозу γ- излучения в дозе 1 Гр и сохраняют плюрипотентные свойства при культивировании ex vivo [80]. Также важно то, что для экспансии VSELs ex vivo требуется всего 5-10 дней в культуре [80, 81]. Это открывает возможности для их дальнейшего исследования в качестве клеточной терапии при острой лучевой болезни.

Продемонстрировано, что фибробласты могут быть перепрограммированы в плюрипотентные стволовые клетки без использования ретровирусов, а только с использованием мРНК для ключевых трансформирующих факторов [82], что открывает дорогу методам регенеративной медицины.

Однако, экспансия in vitro связана с повышенным риском нежелательных эпигенетических модификаций [83]. Это тормозит использование этой методики в терапии острой лучевой болезни.

Макрофаги. Было показано, что макрофаги, с активированным toll-подобным рецептором 9, способны продуцировать ВВ снижающие пострадиационное повреждение кишечника. Это проявляется в сохранности гистологического строения системы ворсинка-крипта при облучении мышей в дозе 18 Гр [84]. Активированные макрофаги поддерживают регенерацию крипт, координируют сигналы от кишечной микробиоты и поврежденного эпителия и активизируют регенерацию кишечных стволовых клеток [85]. Было показано что ВВ макрофагов из различных источников обладают ангиогенным действием [86]. Внеклеточные везикулы макрофагов с фенотипом M2 в модели атеросклероза оказывают противовоспалительное действие [87].

 

Таблица 1. Экспериментальная клеточная терапия, направленная на коррекцию костномозговой формы острой лучевой болезни

Table 1. Experimental cell therapy aimed at correcting the bone marrow form of acute radiation sickness

 

Таблица 2. Экспериментальная клеточная терапия, направленная на коррекцию кишечной формы острой лучевой болезни

Table 2. Experimental cell therapy aimed at correcting the intestinal form of acute radiation sickness

 

Таблица 3. Экспериментальная клеточная терапия, направленная на коррекцию церебральной формы острой лучевой болезни

Table 3. Experimental cell therapy aimed at correcting the cerebral form of acute radiation sickness

 

Потенциально массовый характер заболевания острой лучевой болезнью накладывает существенные ограничения на разрабатываемые методики регенеративной медицины. Требования низкой иммуногенности обуславливает необходимость смены парадигмы с трансплантации стволовых клеток на введение внеклеточных везикул. Во-первых, внеклеточные везикулы более стабильны чем стволовые клетки и их хранение в течении длительного времени легче обеспечить, что как следствие делает более осуществимым их промышленное производство и стандартизацию. Во-вторых, сами внеклеточные везикулы не обладают канцерогенным потенциалом или риском анеуплоидии, поскольку они не способны к репликации. В-третьих, из-за небольшого размера внеклеточные везикулы могут преодолевать практически все тканевые барьеры, включая гематоэнцефалический барьер [90].

Однако, для оценки их специфических клеточных и тканевых эффектов необходимы сравнительные исследования эффективности экспериментального лечения различными видами стволовых клеток и клеток предшественниц. На сегодняшний день слабо исследованы особенности медико-биологических эффектов внеклеточных везикул в зависимости от продуцирующих её клеток и их структурно-функционального состояния (таблица 4). Слабо изучены эффекты их совместного применения со стволовыми клетками, что могло бы способствовать росту выживаемости последних, либо повлиять на их распределение в организме. Это позволит обеспечить поддержку клеточных компартментов, стволовых ниш и микроокружения, при острой лучевой болезни.

 

Таблица 4. Внеклеточные везикулы их эффекты in vivo при моделировании радиационного поражения

Table 4. Extracellular vesicles and their in vivo effects in radiation damage modeling

 

Второй особенностью сравнительных исследований является хронологический аспект. Разная скорость пролиферации и дифференцировки гематогенного, нейрогенного, эпидермального дифферонов, дифферона кератиноцитов, особенности клеточно-тканевых компенсаций определяют необходимость поэтапной коррекции. Это может стать последующим направлением исследований применения внеклеточных везикул при острой лучевой болезни.

Заключение

            Таким образом, трансплантация гемопоэтических стволовых клеток, как компонента донорского костного мозга прочно вошла в практику. Однако, обеспечение прогресса в лечении кишечной и церебральных форм лучевой болезни, её осложнений, а также местных лучевых поражений связана с необходимостью разработки более селективных клеточных препаратов, для чего необходимы исследования изолированных пулов стволовых клеток. Из последних показана эффективность внутривенной и интраперитонеальной трансплантации мезенхимальных, нейральных клеток и клеток-предшественниц, а также их внеклеточных везикул. Наиболее изучена трансплантация мезенхимальных стволовых клеток, которые обладают эффективностью по отношению к гематогенному, кишечному и церебральному синдромам острой лучевой болезни. Их эффект достигается за счет снижения воспаления и коррекции микроокружения эндогенных стволовых клеток, что влечет увеличение выживаемости и снижение апоптоза, но, к сожалению, фактически ни в одном клиническом протоколе не была показана их эффективность Исследования эффектов эндотелиальных предшественниц исследованы гораздо слабее, но обладают той же широтой эффектов. Трансплантация нейральных стволовых клеток и их внеклеточных везикул, рассматриваться в качестве вероятной вспомогательной терапии.

Дополнительная информация.

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении поисково-аналитической работы.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. В.В. Криштоп — планирование исследования, сбор, анализ и интерпретация литературных данных, подготовка и написание текста статьи; П.С. Пащенко— разработка концепции и дизайна, проверка критически важного интеллектуального содержания, окончательное утверждение рукописи; Т.С. Спирина, М.Г. Гайворонская — сбор и анализ литературных источников, подготовка текста рукописи; А.В. Анисин— сбор и обработка материалов, анализ литературных источников. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

Таблица 1. Экспериментальная клеточная терапия, направленная на коррекцию костномозговой формы острой лучевой болезни

Table 1. Experimental cell therapy aimed at correcting the bone marrow form of acute radiation sickness

Клетка Cell	Доза излучения Radiation dose	Вид животного Type of animal	Количество клеток Number of cells	Биологический эффект Biological effect	Источник Source
Клетки-предшес-твенники миело-поеза	ОВТ от 9 до 15 Гр	Мыши	В/в 100 - 150 мкл клеточной суспензии с концентрацией 20×106 кл/мл	Значительный рост выживаемости даже при отсрочке лечения до 7 сут от облучения.	Singh V.K. et al. [18]
МСК	ОВТ 7,0 Гр	Мыши C57/Bl6	В/в 1 × 106/особь	Улучшает восстановление кроветворения повышает выживаемость с 20-25% до 53-60%	Yang X. et al. [30]
МСК	ОВТ 7,8 Гр.	Белые беспородные мыши	В/в и и/п 30, 60 или 120 × 103/особь	При в/в 30, 60, 120 × 103 клеток выживаемость повышалась на 53,5%, 40 % и 23,5%, соответственно. При и/п введении снижения выживаемости по мере роста концентрации клеток не наблюдалось. Выявлено более быстрое восстановлению содержания эритроцитов, наиболее существенно при и/п введении.	Мурзина Е.В. и соавт. [88]
МСК	ОВТ 7-8Гр		В/в 1×106/особь	Восстановление лейкоцитов и тромбоцитов было сравнимо с таковым при трансплантации ГСК, при котором нормализация лейкоцитов достигается к 4-й неделе.	Ланге К. [14]
МСК и  лимфоидные  и мегакариоцитарные ,  гранулоцитарно-макрофагальные и эритроидные КОЕ	ОВТ 8 Гр	Приматы	-	Сокращает период и снижает тяжесть радиационной панцитопении, ускоряет восстановление лейкоцитов периферической крови	Thierry D. et al [4]
Эндотелиальные клетки-предшественницы	ОВТ 10,5 Гр	мыши C57Bl6	В/в 1×106/особь	Рост максимального времени жизни после облучения с 20 сут до 31 сут.	Rios C. et al. [77] Chute J.P. et al [79]
Эндотелиальные клетки-предшественницы	ОВТ 7 Гр	мыши C57Bl6	В/в и и/п по 1×106/особь	Значительное увеличение выживаемости и кроветворения.	Chute J.P. et al [78]

Прим: ОВТ – облучение всего тела, в/в – внутривенный путь введения, и/п – интраперитонеальный путь введения.

 

Таблица 2. Экспериментальная клеточная терапия, направленная на коррекцию кишечной формы острой лучевой болезни

Table 2. Experimental cell therapy aimed at correcting the intestinal form of acute radiation sickness

Клетка Cell	Доза излу-чения Radiation dose	Вид живот-ного Type of animal	Количество клеток Number of cells	Биологический эффект Biological effect	Источник Source
МСК	ОВТ 10 Гр	мыши BALB/c	В/в 2×106 /особь	Рост среднего времени выживания и снижение морфологических изменений в подвздошной кишке через 7 дней	Suzuki F. et al. [89]
МСК	ОВТ 10 Гр или ОБП 16–20 Гр	мыши C57BL/6	В/в 2×106 /особь	Рост числа стволовых клеток эпителия в основании крипт в 10 раз. Все мыши, с трансплантацией, выживали в течение более 25 дней	S. Saha et al. [37]
МСК	ОБП 12 Гр	крысы Sprague- Dawley	В/в 2×106 клеток, 1 мл	Гистологические показатели лучевого поражения кишечника в экспериментальной группе отсутствовали	Zheng K. et al. [38]
Макро-фаги	ОВТ 18 Гр	Мыши	В/в в 500 мл на мышь 60 мг на 50 мл	60% выживаемость в течение 20 дней, против 100% летального исхода в группе сравнения на 7-12 день. Морфология системы ворсинка-крипта сохраняется	S. Saha et al. [84]
МСК	ОВТ 10,5 Гр	мыши	В/в 5×106 /особь	Увеличение пролиферации и уменьшение гибели клеток в эпителиальных клетках крипт и продлевает жизнь с 5 сут до 10 сут	Semont A et al. [39]
МСК	ОВТ 14 Гр	Мыши C57BL/6	В/в 1×106 /особь	Увеличение количества стволовых клеток кишечного эпителия, Ki67+ энтероцитов и клеток Панета, так же через 6 снижение апоптоза. Среди мышей с трансплантацией МСК, 20% выжили в течение 30 дней после облучения. В контрольной группе на 15 сут отмечалась 100% смертность.	Gong W. et al. [40]

Прим. ОВТ – облучение всего теля; ОБП – локальное облучение брюшной полости, в/в – внутривенный путь введения.

 

Таблица 3. Экспериментальная клеточная терапия, направленная на коррекцию церебральной формы острой лучевой болезни

Table 3. Experimental cell therapy aimed at correcting the cerebral form of acute radiation sickness

 

Клетка Cell	Доза излучения Radiation dose	Вид животного Type of animal	Количество клеток Number of cells	Биологический эффект Biological effect	Источник Source
МСК	ОГ 10 Гр за 2 фракции (2 × 5 Гр)	Мыши	Интраназально 5 × 105/особь, 1 р в неделю в течении 4 недель	Улучшает неврологические функции. Увеличивает максимальную продолжительность жизни не изменяя медианную. Способствует сохранению NeuN+ клеток, не затрагивая Ki67+ и DCX+ гиппоталамуса и уровень BDNF	Soria B. et al. [49]
МСК	ОГ 15 Гр	Мыши BALB/c	Инъекция в кору полушария головного мозга в количестве 1,0 ×105/особь	Снизила каспазо-1-зависимый пироптоз микроглии	Liao H. et al. [50]
НСК.	ОГ 10 Гр	Иммунно-дефицитные безтимусные голые крысы	Инъекция в гиппокамп в количестве 4,0 × 105/особь	Улучшение когнитивных функций в течение 8 мес	Acharya M.M. et al. [72]
НСК	ОГ 10 Гр и ОВТ 5 Гр	Мыши C57BL/6	Инъекция в латеральную субвентрикулярную зону (SVZ) зубчатой извилины гипоталамуса в количестве 5000/особь и в/в 1-4×106/особь	Усиление эндогенного нейрогенеза, миграция, пролиферация и дифференцировка введенных клеток в нейроны и глию	Belkind-Gerson J. et al. [73]
НСК	ОГ 20 Гр (4×5Гр)	Мыши C57BL/6	В/в 1×106/особь	Миграция и дифференцировка в нейроны, астроциты, олигодендроглиоциты или эндотелиоциты. Рост секреции NGF	Joo K. et al. [74]

Прим. ОВТ – облучение всего тела; ОГ – локальное облучение головы

 

Таблица 4. Внеклеточные везикулы их эффекты in vivo при моделировании радиационного поражения

Table 4. Extracellular vesicles and their in vivo effects in radiation damage modeling

Клет-ка Cell	Донор Donor	Модель Model	Реципиент Recipient	Количество ВВ и путь введения EV count and route of administration	Биологический эффект Biological effect	Источник Source
МСК	ККМ человека	ОВТ 7 Гр	Мыши C57Bl/6J	В/в введение 100 мкм суспензии спустя 1 неделю после облучения	Достоверное уменьшение потери веса, и снижения количества В-л имфоцитов периферической крови через 3 и 6 нед после облучения, улучшают долю животных полностью восстановивших гистологическую структуру печени и селезенки спустя 6 мес после облучения	Alchinova I.B. et al. [91]
	ККМ человека	ОВТ 10 Гр	«Голые» мыши	В/в введение спустя 6, 24, и 48 ч	Снижение на 85% риска мгновенной гибели. Стимуляция пролиферации и снижение апоптоза энтероцитов крипт тонкого кишечника. Восстановление выросшей проницаемости слизистой оболочки	Accarie A. et al. [92]
	ККМ мыши C57Bl/6J	ОВТ 9,5 Гр	Мыши C57Bl/6J	В/в введение 150 мкм суспензии после облучения	Рост долгосрочного выживания, за счет восстановления кроветворения в ККМ спустя 30 суток после облучения, но не краткосрочного восстановления	Schoefinius J.S. et al. [93]
	ККМ мыши	Тотальное облучение 9,5 Гр	Мыши C57BL6/J	В/в введение ВВ, полученных из 106 МСК в 150 мкл бессывороточной среды, группе сравнения вводили 106 ММСК	ВВ-МСК в большей степени чем сами МСК ускоряют восстановление тромбоцитов крови	Schoefinius J.S. et al. [93]
	Плацента человека	ОВТ 15 Гр	Мыши C57BL/6J	В/в введение 100 мкм суспензии сразу после облучения, а также спустя 2 и 3 дня	ВВ концентрировались в поврежденном кишечнике животных, уменьшая апоптоз, воспаление и усиливая ангиогенез.	He N. et al. [94]
	Головной морг мышиC57Bl/6	ОГ 8 Гр	Мыши C57Bl/6	Интраназальное в дозе 5 мкг (по белку)/мышь в течение 4 недель, начиная через 48 часов после облучения	Показано снижение уровней экспрессии провоспалительных цитокинов, кроме TNFα, до уровня контроля, что соизмеримо с противовоспалительной активностью дексаметазона	Ратушняк М.Г. и соавт. [95]
	Крысы  Sprague- Dawley	ОВТ 15 Гр	Крысы  Sprague- Dawley	В/в введение 400 мкм суспензии сразу после облучения	Снижают вызванную радиацией потерю костной массы коленного сустава левой задней конечности	Zuo R. et al. [96]
ЭП	Костный мозг мыши C57BL/6 и  B6.SJL	ОВТ 5 и 8 Гр	Мыши C57BL/6	В/в введение 200 мкм суспензии спустя 24 ч. после облучения	Снижение смертности, повреждения ККМ, его сосудов, рост числа КОЕ, гибели клеток ККМ путем апоптоза было характерно для ВВ как сингенных так и аллогенных животных	Piryani B.S. et al. [97]
	ККМ мыши C57BL/6	ОВТ 5 Гр, и 8 Гр	Мыши C57BL/6	В/в ежедневное введение 1,9 × 109 частиц ВВ в течение четырех дней	улучшение клеточного состава ККМ, содержания ГСК и клеток-предшественников, сохранение архитектуры эндотелиальных клеток и увеличили процент выживших животных на 50%.	Piryani B.S. et al. [97]
Нейроны	Культуры индуцированныхплюрипотентных стволовых клеток человека ((iCell GABANeurons, 01434, FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc, Madison, WI) и (iCell GlutaNeurons, 01279, FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc, Madison, WI).	ОГ 8,67 Гр на 1, 3, 5 сутки	Крысы Fischer 344	В/в введение суспензии на 8, 15 и 22 день после облучения	Крысы, получавшие ВВ ГАМК –эргических нейронов, показали улучшение в поведенческих задачах, зависящих от гиппокампа и коры и сохранили пространственную плотность дендритных шипиков гранулярных нейронов характерную для интактных животных. Для ВВ глутаматергических нейронов эти изменения были не характерны.	Smith S. et al. [98]
Макро-фаги	ККМ из обеих бедренных и большеберцовых костей мышей	Локально. Участок нижней части груди размером 2 см2, дозой 18 Гр	Мыши	В/в введение суспензии на 1 и 24 часа после облучения	Предотвращает снижение высоты ворсинок, и количества крипт через 3,5 дня после облучения. Способствует 40% выживаемости в течении 2 мес, в то время как все мыши группы сравнения гибли с 10 по 20 сутки	Saha S. et al. [84]

 

 

作者简介

Vladimir Chrishtop

Military Medical Academy named after S.M. Kirov

Email: chrishtop@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9267-5800
SPIN 代码: 3734-5479

Senior Researcher at research center of the Military Medical Academy named after S.M. Kirov

俄罗斯联邦, Saint Petersburg

Alexey Anisin

Military Medical Academy named after S.M. Kirov

Email: av.anisin@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4555-953X
SPIN 代码: 1213-3797
Scopus 作者 ID: 950276

Deputy Head of the Research Center of the Military Medical Academy named after S.M. Kirov

俄罗斯联邦, Saint Petersburg

Pavel Pashchenko

Military Medical Academy named after S.M. Kirov

Email: pashchenkops@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2711-7711
SPIN 代码: 1035-3261

Doctor of Medicine, Professor, department of human anatomy

俄罗斯联邦, Saint Petersburg

Tatyana Spirina

National Medical Research Center named after V.A. Almazov; Saint Petersburg State University

Email: ScoX1@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0002-1188-7204
SPIN 代码: 1048-9599

Associate Professor of the department of anatomy; associate Professor of the department of morphology

俄罗斯联邦, Saint Petersburg; Saint Petersburg

Maria Gaivoronskaya

National Medical Research Center named after V.A. Almazov; Saint Petersburg State University

编辑信件的主要联系方式.
Email: solnushko12@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4992-9702
SPIN 代码: 2357-5440
Scopus 作者 ID: 57028288500

Doctor of Medicine, Associate Professor, professor of the department of anatomy; professor of the department of morphology

俄罗斯联邦, Saint Petersburg; Saint Petersburg

参考

补充文件