The feasibility of detecting tryptase-positive tumour-associated mast cells in sporadic medullary thyroid carcinoma



如何引用文章

全文:

开放存取 开放存取
受限制的访问 ##reader.subscriptionAccessGranted##
受限制的访问 订阅或者付费存取

详细

BACKGROUND: To date, there have been no studies that have investigated the role of mast cells in the development of sporadic medullary carcinoma of the thyroid. However, there is evidence that they are involved in the progression of epithelial malignancies of various localisations and as an independent predictor of long-term progression-free survival in neuroendocrine tumours of the pancreas.

AIM: To show the possibilities of immunohistochemical detection of TC in the tumour microenvironment of sporadic MCRC.

METHODS: The present study was conducted on histological sections of paraffin blocks of sporadic medullary thyroid carcinoma, with the use of immunohistochemical detection of mast cell tryptase. Subsequently, a CNN (convolutional neural network) model was trained for the segmentation of DAB-stained cells, followed by the calculation of the results.

RESULTS: The results of the study revealed a number of possible clinically significant correlations, including: a correlation between the number of mast cells in the thyroid stroma and the age of patients; a correlation between the number of mast cells detected in the tumour at different stages according to the 8th edition of the TNM classification; and peculiarities of co-localisation of mast cells with other cells in the tumour environment.

CONCLUSION:

The study provides evidence for the presence of mast cells in the stroma of medullary carcinoma, and for quantitative differences in mast cell numbers at different node sizes. The active effect of TC on atypical cells of sporadic medullary thyroid carcinoma and other components of the tumour microenvironment, as detected in the study, is an important criterion for interpreting the biological effects of TC in relation to the tumour. Further analysis is required for the development of diagnostic algorithms and the improvement of prognosis objectivity.

全文:

Обоснование

Медуллярная карцинома щитовидной железы (МКЩЖ) — злокачественная опухоль, развивающаяся из кальцитонин продуцирующих парафолликулярных С-клеток щитовидной железы (ЩЖ) [1]. МКЩЖ оставляет приблизительно 2% от всех злокачественных новообразований щитовидной железы и в 25% является наследственной, возникающей в результате аутосомно-доминантных мутаций зародышевой линии с усилением функции в протоонкогене RET, что указывает на синдром множественной эндокринной неоплазии (МЭН2A или МЭН2B). При этом этиология спорадических форм до сих пор неизвестна [2].

 

Течение МКЩЖ на данный момент непредсказуемо, клинические формы вариабельны – от индолентных до фульминантных. Разработка классификации МРЩЖ с учетом молекулярных особенностей и стратификации риска прогрессии заболевания имеет ключевое значение для оптимизации алгоритмов лечения пациентов с этим типом карциномы. На сегодняшний день по данным большинства мировых клинических рекомендаций основным методом лечения является хирургический, объем которого сводится к тиреоидэктомии с центральной лимфодиссекцией, при этом необходимо учитывать достаточно высокие риски осложнений [3, 4, 5, 6, 7, 8] Стратификация МКЩЖ позволит выделить группы пациентов, которым могут быть показаны более агрессивные методы лечения, а также тех, у кого заболевание протекает более медленно и требует лишь динамического наблюдения. Внедрение молекулярной стратификации поможет точнее прогнозировать ответ на лечение, минимизировать побочные эффекты терапии и улучшить общие показатели выживаемости. Кроме того, такая классификация станет основой для разработки новых таргетных терапий, направленных на конкретные молекулярные мишени, что повысит эффективность лечения и улучшит качество жизни пациентов. На сегодняшний день стратификация рисков основана только на индексе пролиферативной активности и наличии некрозов в опухоли, продолжается поиск новых маркеров и предикторов заболевания [9].

 

Роль тучных клеток (ТК) в развитии патологий ЩЖ рассмотрена недостаточно. Известно, что ТК являются частью врожденного иммунитета, участие ТК в патогенезе аллергических заболеваний изучено достаточно подробно [10]. Несмотря на ограниченное количество исследований на данный момент выявлено, что ТК играют значительную роль в патофизиологии ЩЖ. В исследовании Zdor и соавт. продемонстрирована взаимосвязь количества выявляемых ТК и различных неопухолевых поражений ЩЖ. При воздействии избыточного количества тиреоидных гормонов в ЩЖ запускается воспалительная реакция, и ТК сверхэкспрессируют костимулирующий CD86 в ЩЖ, что подтверждает их участие в презентации аутоантигенов [11]. ТК также участвуют в регуляции микроциркуляции и ангиогенеза, влияя на функциональную активность тиреоцитов. Полученные рядом авторов данные свидетельствуют о том, что ТК, экспрессирующие факторы роста, могут играть решающую роль в восстановлении ткани ЩЖ при подостром тиреоидите, модулируя фолликулогенез и ангиогенез [12].

 

Доказано участие ТК в прогрессировании новообразований различных локализаций.  Среди различных популяций клеток, инфильтрирующих раковую строму, именно ТК могут влиять на несколько аспектов биологии опухоли, включая развитие и прогрессирование опухоли, ангиогенез, лимфангиогенез и ремоделирование тканей [13, 14, 15]. При развитии и росте опухоли наблюдается таргетная дегрануляция ТК, что сопровождается высвобождением факторов, стимулирующих ангиогенез и метастазирование [16, 17]. В свою очередь при злокачественных новообразованиях ЩЖ (папиллярной, фолликулярной, дифференцированной высокозлокачественной и низкодифференцированной карциномах) инфильтрат ТК увеличивается по сравнению с нормальной тканью, а их плотность коррелирует с плохим прогнозом [18].

 

Требуют отдельного внимания и особенности гистогенеза МКЩЖ. Этиология данной карциномы кардинально отличается от иных образований ЩЖ.  Принято считать, что МКЩЖ относится к нейроэндокринным опухолям [19]. По данным исследований Mo и соавт. и Meng и соавт., высокая плотность тучных клеток является независимым предиктором длительного выживания без прогрессирования при локализации нейроэндокринных опухолей в поджелудочной железе разной степени злокачественности (Grade 1, 2, 3) [20].

 

На сегодняшний день нет исследований, направленных на изучение роли ТК в течении спорадической медуллярной карциномой ЩЖ, что, учитывая разные концепции исследователей, делает эту проблему несомненной актуальной.

Цель

Цель данного исследования: показать возможности иммуногистохимической детекции ТК в толще спорадической МКЩЖ.

Материалы и Методы

Материалы и методы

От всех включенных в исследование участников было получено информированное согласие. Всего в данном исследовании приняли участие 43 человека: 12 мужчин и 31 женщина в возрасте 40-65 лет. Каждому образцу был присвоен индивидуальный номер для обезличивания при дальнейшем исследовании. Всем пациентам на дооперационном этапе по результатам молекулярно-генетического исследования (МГИ) периферической крови с использованием метода NGS герминальных патогенных и условно-патогенных SNV в гене RET выявлено не было.  Всем пациентам проведено хирургическое лечение ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» Минздрава России (ЭНЦ) в период с 2020 по 2024 год в объеме тиреоидэктомии (76,5%) и гемитиреоидэктомии (23,5%). Распределение пациентов согласно классификации, TNM 8th представлено в таблице 1. 

 

 

 

Неравномерность выборки обусловлена особенностями работы ЭНЦ, в которой уделяется большое внимание ранней диагностике, выявлению и лечению медуллярной карциномы.

 

Иммуногистохимическое исследование

Для иммуногистохимического исследования после депарафинизации срезы были подвергнуты извлечению антигена путем нагревания срезов в парогенераторе с буфером для восстановления эпитопов R- UNIVERSAL (Aptum Biologics Ltd., Саутгемптон, SO16 8AD, Великобритания); при 95 -C - 30 мин. Блокирование эндогенных Fc-рецепторов перед инкубацией с первичными антителами было исключено согласно опубликованным рекомендациям [21]. После демаскировки антигена и нейтрализации эндогенной пероксидазы, срезы были подвергнуты иммуногистохимическому окрашиванию первичными антителами к триптазе в разведении 1:2000 (моноклональные антитела мыши # ab2378 производитель AbCam, Великобритания). 

 

U-Net сегментация триптаза-позитивных клеток

               Для обучения сверточной нейронной сети (CNN, convolutional neural network), предназначенной для сегментации триптаза-позитивных (DAB+) клеток, была сформирована выборка из 67 полнослайдовых изображений (WSI) иммуногистохимических препаратов. На изображениях были выделены 694 области интереса с положительно окрашенными клетками и без таковых, размером 512×512 пикселей при разрешении 0,5029 мкм/пиксель и увеличении ×20. Экспертная аннотация этих областей была произведена в программе QuPath версии 0.5.1 [22]. В дальнейшем осуществлялась бинаризация изображений с присвоением значения «1» иммунопозитивным участкам и «0» — иммунонегативным зонам. Итоговый набор включал 694 бинарные маски и соответствующие им исходные изображения иммуногистохимических препаратов. Общий массив данных был стратифицирован на три подвыборки: 541 изображение для тренировочной (78%), 73 — для тестовой (10,5%) и 80 — для валидационной (11,5%) выборок. Обучение проводили в программе DeepMIB версии 2.91 beta20 (Университет Хельсинки, Финляндия) [23]. Сегментация осуществлялась с применением сверточной нейронной сети архитектуры U-Net с тремя уровнями глубины и 32 фильтрами. Для сохранения исходного разрешения изображений понижение дискретизации не применялось. После первичного обучения была реализована методика «human-in-the-loop» для верификации результатов квалифицированным патоморфологом, что позволило расширить аннотированную выборку до 808 изображений (655 изображений в тренировочной выборке). Патоморфолог внёс корректировки в 114 изображений с недостаточными и ошибочными сегментациями, после чего было произведено повторное обучение в течение 500 эпох. В ходе обучения применялась аугментация данных.               Оценка качества модели производилась с применением следующих метрик: коэффициент пересечения (Intersection over Union, IoU), граничный F1-показатель (Boundary F1-Score) и точность (Accuracy). Модель применяли к тестовому набору данных с помощью программы FastPathology версии 1.1.3 (Норвежский университет науки и технологий, Норвегия). Верификация модели осуществлялась на выборке, включающей все полнослайдовые изображения. Полученные результаты сегментации иммунопозитивных клеток были подвергнуты количественному анализу в программе QuPath.Этическая экспертизаИсследование рассмотрено и одобрено локальным этическим комитетом ФГБУ «НМИЦ эндокринологии им. академика И.И. Дедова» Минздрава России (Россия, г.Москва) протокол №1 от 15 января 2025 года.

Статистический анализ

Статистический анализ осуществляли в программной среде R версии 4.4.0 (R Foundation, Австрия) с использованием стандартных методов обработки данных. Для оценки соответствия модели проводили корреляционный анализ между плотностью DAB⁺ клеток в опухолевых и вне опухолевых зон и качественной оценкой, выполненной патоморфологом, с использованием коэффициента корреляции Спирмена. Количественные данные описаны при помощи среднего значение (Ср. знач.) и стандартного отклонения (СО), медианы и 1 и 3 квартиля (25, 75 перцентиль), минимального и максимального значения. Проводилась оценка метрик IoU, F1-Score и Accuracy для каждого изображения тестовой выборки. Достоверность принимали при p значении на уровне 0,05.

 

 

Результаты

Обученная модель (рис 1.) продемонстрировала следующие метрические показатели для класса 1: точность (Accuracy) составила 0,75, коэффициент пересечения (IoU) — 0,57, а среднее значение граничного F1-показателя (BF) — 0,85 (табл. 2). Несмотря на удовлетворительные результаты оценки модели, высокий процент ложноотрицательных сегментаций указывает на необходимость увеличения объема обучающей выборки. Коэффициенты корреляции Спирмена при оценке количества DAB-положительных клеток для регионов WSI «опухоль» и «вне опухоли» составили 0,70 и 0,42 соответственно, что свидетельствует о сильной и умеренной положительной корреляции между результатами работы модели и экспертной оценкой патоморфолога.

По результатам проведенного исследования выявлен ряд возможных клинически значимых корреляций.

Отмечена взаимосвязь количества тучных клеток в строме щитовидной железы с возрастом. Данные изменения могут быть по нескольким причинам. Как известно,  количество тучных клеток меняется при различных аллергических реакциях, а так же при аутоиммуном процессе. По скольку данный показатель не коррелируется с классификацией TNM 8th  , то расценивать его как клинически значимый в онкогенезе на малой выборке не стоит. Эти данные могут указывать на необходимость проведения более широкого обследования пациентов для выявления иных взаимосвязей с увеличенным числом тучных клеток.

Мы выявили заметную корреляцию количества выявляемых тучных клеток в опухоли при различных «Т» (таб.3). Если рассматривать среднее значение, то чем выше Т, то их больше, однако, важно учитывать, что данный критерий согласно классификации, установлен в зависимости от размера опухоли и не всегда равен той же сумме при перерасчете на площадь (таб.4). При рассмотрении количества на мм2, выявляется тот факт, что различия между T1b и T2 минимальное, что может свидетельствовать о «переходе» опухоли от одного состояния в другое и тут очень важно понимать, а какова роль тучных клеток и меняется ли она с этапами прогрессирования.

При пересчете на процентное содержание тучных клеток к клеткам опухоли, данные еще больше меняются (таб.5). Выявлено что среднее значение этого показателя больше при T1b, чем при Т2, что еще раз подчеркивает возможное влияние тучных клеток на прогрессирование или регрессирование медуллярной карциномы.

 

          Кроме количественных различий, обращают на себя внимания особенности солокализации ТК с иными клетками в опухолевом окружении. Наблюдаются особенности секреции гранул, клеточных контактов. Именно это свидетельствует о необходимости дальнейшего изучения гистотопографических и цитологических особенностей триптаза-позитивных ТК, а также применения дополнительных маркеров для более детального иммунофенотипирования окружающих клеток и матрикса структур (рис.2).

 

 

 

Заключение

Проведенное исследование доказывает наличие тучных клеток в строме медуллярной карциноме и их количественные различия при разном размере узла.

Данное исследование требует расширения и равномерности выборки, однако полученные нами результаты, свидетельствуют о взаимосвязи TNM c количественным соотношениям выявляемых триптаза-позитивных тучных клеток в строме опухоли. Учитывая особенности стадирования и при пересчете в процентное соотношение, можно предположить, что есть «переходные» формы медуллярной карциномы, когда за счет иммунного окружения опухоль может изменить свой злокачественный потенциал.

Эта работа может стать отправной точкой для углубленного изучения роли тучных клеток в развитии спорадической медуллярной карциномы, понимание которой будет способствовать поиску новых мишеней терапии. Кроме того, обнаруженное в исследовании активное воздействие ТК на атипичные клетки спорадической медуллярной карциномы щитовидной железы и другие компоненты опухолевого микроокружения является важными критерием для интерпретации биологических эффектов ТК по отношению к опухоли и заслуживает дополнительного анализа для разработки диагностических алгоритмов и повышения объективности прогноза.

×

作者简介

Ekaterina Bondarenko

Endocrinology Research Center

编辑信件的主要联系方式.
Email: ekaterinabondarenko@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0003-2122-2297
SPIN 代码: 3564-7654
Scopus 作者 ID: 5719350827
Researcher ID: ABB-7019-2022

к.м.н. руководитель центра биобанкирования ФГБУ «НМИЦ эндокринологии им. академика И.И. Дедова» Минздрава России (Россия, г.Москва)

俄罗斯联邦, 117292, Moscow, st. Dmitry Ulyanov, 11

Maxim Balyasin

RUDN University

Email: b.maxim4432@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-3097-344X
SPIN 代码: 9738-4520
Scopus 作者 ID: 57193855756
Researcher ID: B-6324-2017

младший научный сотрудник Российский университет дружбы народов имени Патриса Лумумбы, Научно-образовательный ресурсный центр «Клеточные технологии»

俄罗斯联邦, 117198, Moscow Miklukho-Maklaya str.6

Andrey Kostin

RUDN University

Email: andocrey@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0792-6012
SPIN 代码: 8073-0899
Scopus 作者 ID: 16175361500

MD, Deputy Director

俄罗斯联邦, 117198, Moscow Miklukho-Maklaya str.6

Anastassia Chevais

Endocrinology Research Center

Email: anastassia93@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-5592-4794
SPIN 代码: 2459-0540

к.м.н. врач-эндокринолог

俄罗斯联邦, 117292, Moscow, st. Dmitry Ulyanov, 11

Alexander Alekhnovich

RUDN University

Email: alekhnovich_av@pfur.ru
ORCID iD: 0000-0002-8942-2984
SPIN 代码: 5903-1260
Scopus 作者 ID: 7003610234

д.м.н. первый проректор - проректор по научной 

俄罗斯联邦, 117198, Moscow Miklukho-Maklaya str.6

Fatima Abdulkhabirova

Endocrinology Research Center

Email: abdulkhabirova@endocrincentr.ru
ORCID iD: 0000-0001-8580-2421
SPIN 代码: 2462-1115
Scopus 作者 ID: 15843117900

к.м.н. Заведующая лабораторией цитологии и цитогенетики отдела фундаментальной патоморфологии

俄罗斯联邦, 117292, Moscow, st. Dmitry Ulyanov, 11

Dmitry Atyakshin

RUDN University named after Patrice Lumumba

Email: atyakshin-da@rudn.ru
ORCID iD: 0000-0002-8347-4556

Doctor of Medical Sciences, Director of the Scientific and Educational Resource Center “Innovative Technologies of Immunophenotyping, Digital Spatial Profiling and Ultrastructural Analysis”

俄罗斯联邦, Miklouho-Maklaya st., 6, Moscow, 117198

参考

  1. ПРИМЕР
  2. Список литературы
  3. WHO Classification of Tumours Editorial Board. Endocrine and neuroendocrine tumours. Lyon (France): International Agency for Research on Cancer; 2022. (WHO classification of tumours series, 5th ed.; vol. 10). https://publications.iarc.fr.
  4. Kalezic N. K. et al. Risk factors for sporadic medullary thyroid carcinoma //European journal of cancer prevention. – 2013. – Т. 22. – №. 3. – С. 262-267
  5. Severskaya N. V. et al. Draft clinical guidelines for the diagnosis and treatment of medullary thyroid cancer in adult patients // Endocrine Surgery. - 2022. - Т. 16. - №. 3. - С. 5-23.
  6. Haugen BR, Alexander EK, Bible KC, Doherty GM, Mandel SJ, Nikiforov YE, et al. 2015 American Thyroid Association Management Guidelines for Adult Patients with Thyroid Nodules and Differentiated Thyroid Cancer: The American Thyroid Association Guidelines Task Force on Thyroid Nodules and Differentiated Thyroid Cancer. Thyroid. 2016 Jan. 26 (1):1-133.
  7. NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology: Thyroid Carcinoma. — March 12, 2024.
  8. Filetti, S., Durante, C., Hartl, D., Leboulleux, S., Locati, L. D., … Newbold, K. (2019). Thyroid cancer: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Annals of Oncology. doi: 10.1093/annonc/mdz400.
  9. Ito, Y., Onoda, N., & Okamoto, T. (2020). The revised clinical practice guidelines on the management of thyroid tumors by the Japan Associations of Endocrine Surgeons: Core questions and recommendations for treatments of thyroid cancer. Endocrine Journal. doi: 10.1507/endocrj.ej20-0025.
  10. Кондратович В. А., Жуковец А. Г., Леонова Т. А. Клинико-эпидемиологическая характеристика и прогноз клинического течения медуллярного рака щитовидной железы //Онкологический журнал. – 2021. – Т. 15. – №. 2. – С. 13-18.
  11. Xu B. et al. International medullary thyroid carcinoma grading system: a validated grading system for medullary thyroid carcinoma //Journal of Clinical Oncology. – 2022. – Т. 40. – №. 1. – С. 96-104.
  12. Chekmaryova I. et al. Ultrastructural features of tumor‐associated mast cells in parasympathetic paragangliomas (chemodectomas) of the neck //Microscopy Research and Technique. – 2024. – Т. 87. – №. 6. – С. 1373-1383.
  13. Zdor V. V. et al. Roles of thyroid hormones, mast cells, and inflammatory mediators in the initiation and progression of autoimmune thyroid diseases //International Archives of Allergy and Immunology. – 2020. – Т. 181. – №. 9. – С. 715-726.
  14. Landucci E. et al. Thyroid hormone, thyroid hormone metabolites and mast cells: a less explored issue //Frontiers in cellular neuroscience. – 2019. – Т. 13. – С. 79; Toda S. et al. Growth factor-expressing mast cells accumulate at the thyroid tissue-regenerative site of subacute thyroiditis //Thyroid. – 2000. – Т. 10. – №. 5. – С. 381-386.
  15. Visciano C. et al. Tumor‐associated mast cells in thyroid cancer //International journal of endocrinology. – 2015. – Т. 2015. – №. 1. – С. 705169.
  16. Atiakshin D, Kostin A, Buchwalow I, Samoilova V, Tiemann M. Protease Profile of Tumor-Associated Mast Cells in Melanoma. Int J Mol Sci. 2022 Aug 11;23(16):8930. doi: 10.3390/ijms23168930. PMID: 36012196; PMCID: PMC9408654.
  17. Elieh-Ali-Komi D, Shafaghat F, Alipoor SD, Kazemi T, Atiakshin D, Pyatilova P, Maurer M. Immunomodulatory Significance of Mast Cell Exosomes (MC-EXOs) in Immune Response Coordination. Clin Rev Allergy Immunol. 2025 Feb 20;68(1):20. doi: 10.1007/s12016-025-09033-6. PMID: 39976807; PMCID: PMC11842441
  18. Timofeeva Natalia Yurievna, Bubnova Natalia Vladimirovna, Samakina Ekaterina Stanislavovna, Stomenskaya Irina Stanislavovna, Kostrova Olga Yurievna, Struchko Gleb Yurievich, Kotyolkina Anastasia Andreevna ROLE OF FAT cells in CANCEROGENESIS (LITERATURE REVIEW) // Acta Medica Eurasica. 2023. №1
  19. Komi DEA, Redegeld FA. Role of Mast Cells in Shaping the Tumor Microenvironment. Clin Rev Allergy Immunol. 2020 Jun;58(3):313-325. doi: 10.1007/s12016-019-08753-w. PMID: 31256327; PMCID: PMC7244463.
  20. Melillo R. M. et al. Mast cells have a protumorigenic role in human thyroid cancer //Oncogene. – 2010. – Т. 29. – №. 47. – С. 6203-6215.
  21. M. Nilsson and D. Williams, “On the Origin of Cells and Derivation of Thyroid Cancer: C Cell Story Revisited,” Eur Thyroid J, vol. 5, no. 2, pp. 79–93, 2016, doi: 10.1159/000447333
  22. Mo S. et al. High mast cell density predicts a favorable prognosis in patients with pancreatic neuroendocrine neoplasms //Neuroendocrinology. – 2022. – Т. 112. – №. 9. – С. 845-855; Meng D. et al. Identification of the Immune subtypes for the prediction of Metastasis in pancreatic neuroendocrine tumors //Neuroendocrinology. – 2023. – Т. 113. – №. 7. – С. 719-735.
  23. Buchwalow I. et al. Non-specific binding of antibodies in immunohistochemistry: Fakes and facts //Nature Precedings. – 2011. – С. 1-1
  24. University of Edinburgh, United Kingdom) [Bankhead P. et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis //Scientific reports. – 2017. – Т. 7. – №. 1. – С. 1-7
  25. Pettersen H. S. et al. Code-free development and deployment of deep segmentation models for digital pathology //Frontiers in Medicine. – 2022. – Т. 8. – С. 816281.

补充文件

附件文件
动作
1. JATS XML
下载

版权所有 © Eco-Vector,


Периодический печатный журнал зарегистрирован как СМИ Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор): № 0110212 от 08.02.1993.
Сетевое издание зарегистрировано как СМИ Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор): ЭЛ № ФС 77 - 84733 от 10.02.2023.