Identification of brain macrophages in rats using different antibodies to macrosialin/CD68

全文:

Обоснование

Макрофаги — разнородная по происхождению, фенотипическим и функциональным особенностям популяция клеток, способных к фагоцитозу и представлению антигенов. Современные исследования расширили понимание роли макрофагов: это не только клетки иммунной системы, но и важные регуляторы ремоделирования и функциональной модуляции тканей. Данные способности макрофагов обеспечены совокупностью экспрессируемых рецепторов, секретируемых ферментов, факторов роста и иных цитокинов [1]. Локализация (в том или ином органе) и функциональный статус клеток влияет на спектр эксперссируемых молекул, поэтому они могут значительно отличаться от органа к органу. В частности, в головном мозге, наряду с микроглией, существует несколько популяций типичных макрофагов, которые локализуются преимущественно в в барьерных областях мозга: мозговых оболочках, вблизи кровеносных сосудов, в строме и на поверхности сосудистого сплетения [2, 3, 4]. Несмотря на это, у макрофагов существуют общие маркеры, применяемые для их выявления в различных органах и тканях [5, 6]. К примеру, классическим маркером макрофагов считается CD68 (cluster of differentiation 68, кластер дифференцировки 68) [7, 8].

Кластер дифференцировки 68 человека и его мышиный гомолог макросиалин относятся к семейству белков, ассоциированных с мембранами лизосом (lamp), и обладают высокой степенью гликозилирования [9, 10]. Для данных белков характерно 80,6% совпадение аминокислотных последовательностей [10]. Высокая степень гомологии аминокислотной последовательности этих белков в целом не свидетельствует о гомологии аминокислотных последовательностей антигенных детерминант, что подтверждается при использовании антител к человеческому CD68 на материале крысы [11]. Таким образом, неконсервативность макросиалина приводит к необходимости использования видоспецифических антител. Из этого следует проблема тщательного подбора первичных реагентов для работы с лабораторными грызунами. При этом, первичные антитела являются довольно дорогостоящими реагентами, что ограничивает возможности для широкого скрининга в современных условиях.

Цель

Целью данной работы был сравнительный анализ результатов выявления макрофагов у крыс при использовании кроличьих поликлональных антител к CD68 и мышиных моноклональных антител клона ED1.

Материалы и Методы

Дизайн исследования

Проведено сравнительное исследование применения антител к макросиалину/CD68 двух типов.

Объектом исследования служили срезы головного мозга крыс линии Вистар (n=6), а в качестве внутреннего контроля — срезы сердца и головного мозга мыши, а также сердца крысы. Антитела наносили на последовательные срезы одного случая, а затем сравнивали результаты проявления иммуногистохимической реакции.

Условия проведения

Образцы ткани были фиксированы в цинк-этанол-формальдегиде и залиты в парафин по общепринятой методике. Срезы толщиной 5 мкм изготавливали с помощью ротационного микротома Microm HM 325 (Thermo Scientific, США) и монтировали на стекла с адгезивным покрытием PCL (CITOTEST Labware Manufacturing Co., Ltd, Китай).

Для сравнительной оценки эффективности кроличьих поликлональных и мышиных моноклональных антител было предложено несколько протоколов. Использованные в каждом из этих протоколов реагенты указаны в таблице 1. Реагенты каждого набора использовались согласно рекомендациям производителя.

Перед постановкой иммуногистохимической реакции со срезов удаляли парафин ксилолом и регидратировали в этанолах нисходящей концентрации. После регидратации часть срезов подвергали тепловому демаскированию в буфере S1700 (Agilent, США), после чего все срезы обрабатывали 3% водным раствором перекиси водорода для блокирования эндогенной пероксидазы. Далее приведено более развернутое описание протоколов №№ 3 и 5 (для мышиных моноклональных антител и кроличьих поликлональных антител соответственно), как наиболее эффективных. В качестве первичных реагентов использовали мышиные моноклональные (клон ED1) антитела против CD68 (ab31630, AbCam, Великобритания) в разведении 1:1000 и поликлональные кроличьи антитела против CD68 (GB113109, Servicebio, Китай) в разведении 1:800. Инкубацию проводили в течение 18-20 часов во влажной камере при температуре 27,5°С. В качестве вторичных антител были использованы реагенты из набора Mouse and Rabbit Specific HRP/DAB IHC Detection Kit - Micro-polymer (ab236466, AbCam, Великобритания), предназначенного для выявления кроличьих и мышиных антител. Для предотвращения неспецифического связывания противомышиными антителами родственных иммуноглобулинов крысы к Mouse Specifying Reagent (Complement) из указанного набора добавляли нормальную крысиную сыворотку до 0,5% концентрации конечного раствора. В качестве детектирующего хромогена использовали DAB (Nischerei, Япония). После выявления комплекса антиген—антитело срезы подкрашивали альциановым синим, подвергали дегидратации в изопропиловом спирте и заключали в перманентную среду Cytoseal 60 (Richard-Allan Scientific, США).

Методы регистрации исходов

Микропрепараты фотографировали с помощью микроскопа Leica DM750 (Leica; Германия), оснащенного цифровой камерой ICC50 (Leica; Германия). Работу с изображениями производили в программе Leica LAS EZ (Leica, Германия).

Этическая экспертиза

Исследование одобрено этическим комитетом ФГБНУ «ИЭМ» (протокол № 2/24 от 25 апреля 2024 г.).

Статистический анализ

Статистическая обработка полученных результатов не проводилась.

Результаты

Объекты исследования

Все представленные протоколы позволили выявить CD68-иммунопозитивные структуры в головном мозге и сердце крысы. Предварительный анализ на малом увеличении микроскопа показал, что в мозге макрофаги выявляются в мягких мозговых оболочках, в строме сосудистого сплетения, а также периваскулярно. В контрольных образцах головного мозга и сердца мыши при использовании кроличьих поликлональных антител также были выявлены резидентные макрофаги.

Продукт реакции избирательно накапливается в цитоплазме клеток, морфологически и топографически соответствующих макрофагам (рис. 1). В других клетках головного мозга специфической реакции не наблюдалось. В цитоплазме продукт реакции визуализирует гранулы, как отдельные, так и сливающиеся. Выявление данных типов гранул характерно при использовании обоих видов антител. Также и мышиные, и кроличьи антитела позволяют выявить два типа клеток, различающихся по интенсивности иммуногистохимической реакции: слабоокрашенные и интенсивно окрашенные.

Основные результаты исследования

Для кроличьих поликлональных антител характерно выявление гранул в отростках цитоплазмы, а также фрагментов клеток, не попавших полностью в плоскость среза. Наблюдаемые отростки макрофагов малочисленные толстые и неразветвленные. Мышиные моноклональные антитела преимущественно выявляют клетки, полностью попавшие в плоскость среза. Различия в морфологии и локализации выявленных макрофагов представлены в таблице 2. Сравнение препаратов, прошедших процедуру теплового демаскирования, с препаратами, которые этой процедуре не подвергались, позволило выявить следующее. Во-первых, интенсивность специфической реакции при использовании мышиных моноклональных антител выше при выполнении теплового демаскирования, чем при исключении данной процедуры. И наоборот, существенного улучшения результата реакции при проведении теплового демаскирования с последующим применением кроличьих поликлональных антител не наблюдается. Во-вторых, интересным эффектом этапа теплового демаскирования является значительное подавление неспецифического связывания мышиных антител при использовании блокирующих реагентов. При отсутствии процедуры теплового демаскирования просветы сосудов, а также спинномозговая жидкость окрашиваются светло-коричневым цветом, тогда как при проведении теплового демаскирования интенсивность неспецифической реакции уменьшается. В случае применения кроличьих антител возникновение неспецифического связывания нехарактерно и от этапа теплового демаскирования не зависит.

При анализе макрофагов различной локализации было обнаружено, что периваскулярные и менингиальные макрофаги, выявленные при помощи кроличьих поликлональных антител, хорошо обнаруживаются даже на малом увеличении микроскопа. Макрофаги, выявленные с помощью мышиных моноклональных антител, в оболочках и возле сосудов обнаруживаются преимущественно при большом увеличении (см. рис. 1), а при малом практически незаметны. Макрофаги сосудистого сплетения немногочисленны и одинаково выявляются с помощью обоих видов антител.

Обсуждение

Клон ED1 является традиционно используемым мышиным клоном для выявления макрофагов крысы [5, 12]. Как известно, иммуноглобулины крысы являются родственными с иммуноглобулинами мыши, поэтому использование мышиных антител на материале крысы для непрямой реакции сопровождается появлением неспецифического окрашивания, что снижает качество полученных препаратов. Следовательно, во избежание нежелательного фонового окрашивания требуется использование дополнительных модификаций протокола. Нельзя не отметить, что для выявления мышиных антител на сегодняшний день существует широкий спектр реагентов, что расширяет возможности использования первичных мышиных антител. Одним из направлений улучшения качества реакции (уменьшения фонового окрашивания) является проведение прямой реакции с мышиными антителами. Недостатком такого подхода является низкая амплификация иммуногистохимической реакции. Отмеченная нами низкая интенсивность непрямой реакции указывает на то, что при использовании антител клона ED1 применение прямого метода не подходит. Другим вектором развития технологии селективного выявления макрофагов крыс с помощью данного клона является применение первичных антител, конъюгированных с биотином (авидин-биотиновая система) или полимерной системой [13, 14].

Методический подход, использованный в настоящей работе, состоял в добавлении нормальной крысиной сыворотки к одному из компонентов набора вторичных реагентов (а именно Mouse Specifying Reagent (Complement)) детектирующей системы Mouse and Rabbit Specific HRP/DAB IHC Detection Kit - Micro-polymer и к компоненту Primary Antibody Amplifier из набора UltraVision Quanto Detection System HRP и позволил уменьшить неспецифическое связывание. Представленный в данной статье протокол использования мышиных моноклональных антител позволил выявить макрофаги на сопоставимом с зарубежными работами уровне [15–17], что говорит о его высокой эффективности.

Следует подчеркнуть, что, несмотря на широту использования мышиных антител в качестве первичных реагентов, их использование на срезах тканей крысы сопряжено с усложнениями методических подходов. Это усиливает трудозатраты и стандартизацию полученных результатов.

Большую популярность в последние десятилетия получили первичные реагенты, полученные из других животных, например, кролика. Более того, в условиях санкций ужесточились способы получения и транспортировки зарубежных реагентов (ED1 — Abcam, Великобритания). В соответствии с этим, особую актуальность приобретают более доступные аналоги первичных реагентов. Одним из производителей реагентов-аналогов является фирма Servicebio. Новые кроличьи поликлональные антитела против CD68 крыс [18–20] хорошо зарекомендовали себя в морфологических исследованиях. В результате настоящего исследования эти антитела позволили нам высокоселективно выявить макрофаги крысы, а также мыши. При использовании данных антител была отмечена высокая интенсивность реакции, что упростило поиск клеток на малом увеличении. Главным преимуществом кроличьих поликлональных антител является отсутствие перекрестного связывания вторичных реагентов с иммуноглобулинами тканей крысы. Отсутствие необходимости использования специальных блокирующих реагентов сократило временные затраты на исполнение протокола и уменьшило вероятность появления ложноположительных результатов. Поскольку этап теплового демаскирования при работе с данными антителами является факультативным, то его исключение улучшает сохранность срезов без потери качества реакции (например, при использовании свежеприготовленных срезов). Поскольку кроличьи первичные антитела становятся всё более популярными среди исследователей, то спектр вторичных реагентов для их выявления расширяется, а следовательно, расширяются и возможности их использования.

Заключение

Суммируя изложенные выше факты, можно сказать, что при использовании мышиных моноклональных антител на материале крысы необходимо обязательное проведение процедуры теплового демаскирования, позволяющей повысить интенсивность специфической реакции, и использование реагентов, блокирующих неспецифическое связывание иммуноглобулинов. Напротив, при использовании кроличьих антител в этих процедурах нет необходимости: реакция достаточно интенсивна и специфична. Кроличьи поликлональные антитела позволяют выявлять макрофаги в срезах тканей мыши, тогда как мышиные моноклонаьные антитела этого сделать не позволяют. На сегодняшний день реагенты для выявления мышиных антител представлены шире, чем для выявления кроличьих, однако наблюдается тенденция к расширению ассортимента для выявления последних.

Таким образом, анализ результатов выявления макрофагов головного мозга у крыс при использовании различных по происхождению и клональности антител показал, что использованные кроличьи поликлональные антитела хорошо выявляют макрофаги при более простом протоколе иммуногистохимической реакции, в сравнении с мышиными моноклональными антителами, а потому могут быть рекомендованы в качестве полезной альтернативы для выявления CD68/макросиалина на срезах тканей крысы.

Таблицы

Таблица 1. Перечень использованных реагентов и особенности протоколов.

№ протокола	Первичные антитела	Разведение	Вторичные реагенты	Блокирование неспецифической реакции
1	Мышиные моноклональные (клон ED1) антитела против CD68 (ab31630, AbCam, Великобритания)	1:1000	UltraVision Quanto Detection System HRP (TL-060-QHL; Fisher Scientific, США)	Нормальная крысиная сыворотка, добавленная к Primary Antibody Amplifier
2			Набор N-Histofine MOUSESTAIN KIT (Nichirei, Япония)	Соответствующие реагенты из набора N-Histofine MOUSESTAIN KIT (Nichirei, Япония)
3			Набор Mouse and Rabbit Specific HRP/DAB IHC Detection Kit - Micro-polymer (ab236466, AbCam, Великобритания)	Нормальная крысиная сыворотка, добавленная к Mouse Specifying Reagent (Complement)
4	Поликлональные кроличьи антитела против CD68 (GB113109, Servicebio, Китай)	1:300		нет
5		1:800		нет

 

Таблица 2. Отличительные черты выявленных CD68-положительных клеток.

Характеристика	Локализация в мозге
	Мягкая мозговая оболочка	Периваскулярно	В сосудистом сплетении
Форма клетки	Округлая или овальная, редкие веретеновидные клетки	Веретеновидная	Неправильная отростчатая
Ядро	Округлое или овальное, центрально расположенное	Вытянутое, эксцентрично расположенное	Овальное, эксцентрично расположенное
Гранулы	Сливающиеся	Мелкозернистые отдельные гранулы	Преимущественно отдельные
Локализация гранул	Перинуклеарная	По всей клетке	Преимущественно перинуклеарная; единичные гранулы в отростках клеток
Особенности локализации клеток	Длинная ось клетки параллельна границе мягкой мозговой оболочки	Клетки максимально прилежат к стенке сосуда	Над эпителием сосудистого сплетения, принимая форму межворсинчатого пространства
Групповое расположение клеток	Характерно одиночное расположение	Скопления клеток по периферии сосуда	Одиночное расположение или малыми группами

Рис. 1. Результаты применения различных антител к макросиалину/CD68 у крысы. Anti-CD68 ED1 (Ms) — мышиные моноклональные антитела. Anti-CD68 (Rb) — кроличьи поликлональные антитела. Стрелками указаны макрофаги, * — просветы кровеносных сосудов, m — мягкая мозговая оболочка, V — полость желудочка головного мозга. Увеличение объектива 100х.

作者简介

Anastasiya Beketova

Institute of Experimental Medicine

编辑信件的主要联系方式.
Email: beketova.anastasiya@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0002-8659-733X
SPIN 代码: 6780-2677

лаборант-исследователь лаборатории функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы Физиологического отдела им. академика И.П. Павлова

俄罗斯联邦, Saint Petersburg

Valeria Razenkova

Institute of Experimental Medicine

Email: valeriya.raz@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-3997-2232
SPIN 代码: 8877-8902
Scopus 作者 ID: 57219609984
Researcher ID: AAH-1333-2021

Postgraduate student, Junior Researcher, Laboratory of Functional Morphology of the Central and Peripheral Nervous System, Department of General and Special Morphology

俄罗斯联邦, Saint Petersburg

Olga Kirik

Institute of Experimental Medicine

Email: olga_kirik@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6113-3948
SPIN 代码: 5725-8742
Scopus 作者 ID: 27171304100

PhD, Senior Researcher, Laboratory of Functional Morphology of the Central and Peripheral Nervous System, Department of General and Special Morphology

俄罗斯联邦, Saint Petersburg

Dmitrii Korzhevskii

Institute of Experimental Medicine

Email: dek2@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2456-8165
SPIN 代码: 3252-3029
Scopus 作者 ID: 12770589000

MD, Dr. Sci. (Medicine), Professor

俄罗斯联邦, Saint Petersburg

参考

补充文件