IMMUNOHISTOCHEMICAL DEMONSTRATION OF APOPTOSIS AND NEUROPLASTICITY IN THE CEREBRAL CORTEX OF ALBINO RAT AFTER OCCLUSION OF THE COMMON CAROTID ARTERIES
- Authors: Avdeev D.B.1, Stepanov S.S.1, Gorbunova A.V.1, Akulinin V.A.1, Shoronova A.Y.1
-
Affiliations:
- Omsk State Medical University
- Issue: Vol 156, No 6 (2019)
- Pages: 19-24
- Section: Articles
- URL: https://j-morphology.com/1026-3543/article/view/101794
- DOI: https://doi.org/10.17816/morph.101794
- ID: 101794
Cite item
Full Text
Abstract
Full Text
Введение. Известно, что после острой ишемии запускаются механизмы повреждения нервной ткани путем некроза и апоптоза, а также нейропластичность [2, 12, 13]. Необратимые повреждения нейронов при острой ишемии инициируются через активацию c-Jun N-terminal kinase (JNK). Затем следует апоптоз или вторичный (отдаленный) некроз [10]. При этом активную роль играет каспаза-3, которая обладает как про-, так и антиапоптотическим свойством [5, 6]. Нейропротекторная и нейропластическая функции каспазы-3 могут быть активированы Ca2+-зависимым путем, но точные механизмы пока неизвестны [7-9]. Вероятно, апоптотические протеиназы имеют функции, непосредственно связанные с нейропластичностью. Каспазе-3 присуща плейотропия или мультимодальность, что реализуется в вовлечении этого фермента во множество различных прямо противоположных функций. При развитии церебральной патологии этот фермент опосредует как гибель нервных клеток, так и компенсаторные процессы, необходимые для выживания нейронов и нормального функционирования мозга в целом [7, 8]. Морфологических исследований нервной ткани в этом направлении мало. Ключевыми структурами, связанными с активацией механизмов нейропластичности, являются межнейронные синапсы и нервные отростки [3, 4]. Современные методы иммуногистохимии позволяют выявить эти структуры даже на светооптическом уровне, например, с помощью верификации синаптофизина (терминали - пресинаптическая зона) и МАР-2 (дендриты - постсинаптическая зона) [1, 4]. Ранее мы продемонстрировали ультраструктурные и иммуногистохимические признаки вероятной связи каспазы-3 и синаптической пластичности в гиппокампе белых крыс, перенесших ООСА [1]. Данных о подобном исследовании коры головного мозга крыс в литературе мы не нашли. Целью настоящего исследования явилось иммуногистохимическое изучение сенсомоторной коры (СМК) головного мозга белых крыс в контроле и после 20-минутной ООСА для выявления связи нейропластичности и активности каспазы-3, как одного из ключевых ферментов апоптоза. Материал и методы. Эксперименты проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. № 755) и с рекомендациями Международного комитета по науке о лабораторных животных, поддержанных ВОЗ, директивой Европейского Парламента № 2010/63/EU от 22.09.2010 г. «О защите животных, используемых для научных целей». На проведение исследования было получено разрешение этического комитета ФГБОУ ВО «Омский государственный медицинский университет» (протокол № 83 от 14 октября 2016 г). Работа выполнена на 30 самцах белых крыс Wistar массой 180-200 г, которых содержали в конвенциональном виварии. Животных выводили из эксперимента путем декапитации. 20-минутную ООСА (2-сосудистая модель неполной глобальной ишемии без гипотонии) воспроизводили на фоне премедикации (сульфат атропина 0,1 мг/кг подкожно) и общей анестезии (Zoletil 100 10 мг/кг). Взятие материала проводили через 1 (n=5), 3 (n=5), 7 (n=5), 14 (n=5) и 30 (n=5) сут после ООСА. Группой сравнения служили ложнооперированные (без окклюзии артерий) животные того же возраста через 3 сут после ложной операции (n=5). Головной мозг фиксировали перфузией 4 % раствора параформальдегида на 0,1М фосфатном буфере (рН 7,4) через восходящую часть дуги аорты. Серийные фронтальные срезы (толщина 4 мкм) сенсомоторной коры [11] окрашивали гематоксилином - эозином. Для иммуногистохимического исследования использовали моноклональные мышиные антитела к Caspase-3 (CPP32 - активная форма; код NCL-CPP32, клон JHM62), bcl-2 (код PA0117, клон 3.1), р38 (код ORG-8848, клон 27G12), p53 (код PA0057, клон DO-7) (Лейка Биосистемс Ньюкасл Лтд, Соединенное Королевство) и поликлональные кроличьи антитела к MAP2 (ab32454) (Abcam, США). После реакции с первичными антителами срезы последовательно инкубировали с вторичными антителами, затем с хромогеном DAB (3,3’-диаминобензидин), докрашивали гематоксилином и заключали в полистирол. На микроскопе Leica DM 1000 делали цифровые микрофотографии (по 80 полей зрения с каждого срока), изображение сохраняли в файлах с расширением tiff (2592×1944 пикселей). Для достижения максимальной контрастности и четкости мелких отростков нейронов в Photoshop CC проводили коррекцию изображения с помощью фильтра Camera Raw (контрастность, баланс белого, четкость). Дальнейшее морфометрическое исследование осуществляли на масках 8-битовых черно-белых изображений (об. 40) с использованием программы Image J 1.52. Определяли общую численную плотность нейронов, относительную площадь р38-и каспаза-3-позитивного материала. Проверку статистических гипотез осуществляли непараметрическими критериями Манна-Уитни, ANOVA (однофакторный дисперсионный анализ) Краскела-Уоллиса (StatSoft Statistica 8.0). Результаты представлены как медиана (нижний и верхний квартили). В ходе проведения статистического анализа нулевая гипотеза отвергалась при p≤0,05. Результаты исследования. Гистопатологические изменения в СМК через 1 сут после ООСА показали, что патогномоничным и доминирующим маркером последствий ишемии-реперфузии является появление нейронов с ишемическим повреждением (тёмноокрашенных клеток с гиперхроматозом ядер), находящихся на разных стадиях патологического процесса (несморщенные и пикноморфные без и с гомогенизацией хроматина), которые длительно сохраняются в постишемическом периоде (рис. 1, а, б). Содержание нормохромных нейронов (их численная плотность) через 3 сут после ООСА статистически значимо уменьшалось в слое III в 1,6-7,9 раза, а в слое V - в 2,8-3,9 раза (p<0,05). В отдаленном периоде (на 30-е сутки) отмечались небольшие скопления темных сморщенных нейронов. Это свидетельствует о том, что после 20-минутной ООСА бóльшая часть гиперхромных ишемических нейронов не подвергаются необратимой деструкции и фагоцитозу, а сохраняются в течение всего периода наблюдения. Через 30 сут в слое III дефицит общей численной плотности нейронов составил 21,5 %, а в слое V - 19,0 %. Сохранившиеся нормохромные нейроны имели гипертрофированные тела. Вероятно, именно за счет подобных нейронов осуществляется реорганизация нейронных сетей в СМК. По данным иммуногистохимического исследования, после ООСА белки регуляции апоптоза (р53, bcl-2) выявляются в единичных нейронах СМК. Каспаза-3 имеет высокую активность только в аксонах и синаптических терминалях, а в перикарионах не выявляется. Мы полагаем, что при 20-минутной ООСА апоптоз не имеет существенного значения для элиминации поврежденных нейронов. Каспазу-3 в данном случае целесообразно рассматривать в аспекте ее плейотропии и участия в механизмах нейропластичности. Исследование также показало, что локализация каспазы-3 в СМК соответствует таковой р38 - в стратегических зонах реализации механизмов синаптической пластичности (терминали аксошипиковых, аксодендритических и аксосоматических синапсов). Подобная локализация наблюдается в течение всего периода наблюдения, изменяется только плотность распределения маркера каспазы-3 ир38 между дендритами (МАР-2) (рис. 2, а-в; 3, а-г). Математическая обработка полученных данных показала, что в постишемическом периоде происходит статистически значимое (ANOVA Краскела-Уоллиса, p<0,05) изменение относительной площади (ОП) отростков нейронов (MAP-2-позитивные структуры) в поле зрения. Установлено, что в молекулярном слое СМК у животных контрольной группы ОП отростков в нейропиле составляет 28,6 (24,4-32,5) %. У животных основной группы ОП сначала (1-3 сут) снижается до 21,1 (13,5-23,2) %, затем к 7-м суткам восстанавливается до уровня контроля - 25,6 (21,5-29,9) %, а в отдаленном периоде (14 и 30 сут) превышает контрольное значение - 34,8 (28,5-36,3) и 39,7 (31,4-46,2) % (критерий Манна-Уитни, p<0,05). Это свидетельствует о небольшом, но значимом изменении содержания белка MAP-2, связанном с цитоскелетом нейронов, в ответ на ООСА. Уменьшение содержания этого белка через 1 и 3 сут, вероятно, обусловлено деструкцией цитоскелета. Увеличение содержания MAP-2 в отдаленном периоде можно рассматривать как одно из проявлений нейропластичности - компенсаторной реорганизации отростков сохранившихся нейронов путем гипертрофии (утолщение, удлинение, разветвление). На фоне постишемической реорганизации дендритов и аксонов в СМК происходит изменение ОП меток р38 и каспазы-3 (таблица). В остром периоде (1 и 3 сут) ОП меток р38 и каспазы-3 снижается, вероятно, в результате разрушения синаптических терминалей. Затем, на 7-е сутки этот показатель для р38 восстанавливается до контрольного уровня, а для каспазы-3 - статистически значимо превышает контрольное значение. В отдаленном периоде (14 и 30 сут) ОП каспазы-3 превышает как контрольное значение, так и ОП р38 (см. таблицу). Обсуждение полученных данных. Таким образом, компенсаторная реорганизация отростков нейронов (MAP-2) и синапсов (p38) через 7, 14 и 30 сут после ООСА происходит на фоне высокого содержания каспазы-3 в аксонных терминалях. В норме относительная площадь меток каспазы-3 в СМК статистически значимо не отличается от таковой р38. Использованные нами моноклональные мышиные антитела (CPP32) выявляют активную форму caspase-3 - члена семейства аспартатспецифических цистеиновых протеаз, одного из основных медиаторов клеточного апоптоза. Ее активация происходит на ранних стадиях апоптоза путем самопротеолиза и/или за счет воздействия других протеаз. Однако в последнее время каспаза-3 рассматривается не только как ключевой фермент конечной стадии апоптоза, но и как важный химический компонент нейропластичности [5, 7, 8]. Кроме того, локализация неапоптотической формы этой протеазы совпадает с местами максимального проявления процессов нейропластичности - аксонами и синаптическими терминалями [1, 5, 6]. Наиболее подходящей моделью острой ишемии для проверки этого положения является 20-минутная окклюзия общих сонных артерий, после которой, как правило, возникают умеренные диффузные изменения нервной ткани без очагов некроза [2-4]. С помощью иммуногистохимии нам не удалось показать активацию белков р53 и bcl-2. Кроме того, каспаза-3 в норме и после ООСА была выявлена только в аксонах и синаптических терминалях, а в телах нейронов этот белок отсутствовал. Наличие артефактов окраски нервной ткани в нашем исследовании исключается в силу высокой специфичности меток (окраска только терминалей и аксонов). Все это свидетельствует об отсутствии иммуногистохимических проявлений апоптоза в телах нейронов. При этом в постишемическом периоде количество синаптофизина восстанавливается на фоне высокого относительно контроля содержания каспазы-3 в синаптических терминалях, т. е., по нашим данным, для нейронов СМК при использованной модели ООСА весьма вероятно проявление неапоптотических (плейотропных) нейропротекторных и нейропластических эффектов каспазы-3 без каких-либо признаков ее активации в перикарионе, что необходимо для завершения конечной стадии апоптоза. Заключение. Многообразие функций каспазы-3 широко обсуждается [5, 6], но абсолютное подтверждение ее участия в нейропластичности требует дальнейших молекулярных исследований лигандов этого фермента. Данная работа выполнена при поддержке Фонда содействия инновациям по программе «УМНИК» № 14 от 15.12.2017 г. и внутреннего гранта ФГБОУ ВО «Омского государственного медицинского университета» № 574 от 24.11.2017 г. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: Д. Б. А., С. С. С., А. В. Г., В. А. А., А. Ю. Ш. Сбор и обработка материала: Д. Б. А., С. С. С., А. В. Г., В. А. А., А. Ю. Ш. Статистическая обработка данных: Д. Б. А., С. С. С., А. В. Г., В. А. А., А. Ю. Ш. Анализ и интерпретация данных: Д. Б. А., С. С. С., А. В. Г., В. А. А., А. Ю. Ш. Написание текста: Д. Б. А., С. С. С., А. В. Г., В. А. А., А. Ю. Ш. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.About the authors
D. B. Avdeev
Omsk State Medical University
Email: avdeev86@inbox.ru
12 Lenina St., Omsk 644099
S. S. Stepanov
Omsk State Medical University
Email: serg_stepanov@mail.ru
12 Lenina St., Omsk 644099
A. V. Gorbunova
Omsk State Medical University
Email: double_energy@mail.ru
12 Lenina St., Omsk 644099
V. A. Akulinin
Omsk State Medical University
Email: akulinin@omsk-osma.ru
12 Lenina St., Omsk 644099
A. Yu. Shoronova
Omsk State Medical University
Email: nastasya1994@mail.ru
12 Lenina St., Omsk 644099
References
- Авдеев Д. Б.,Акулинин В. А.,Степанов А. С.,Горбунова А. В., Степанов С. С. Плейотропные ферменты апоптоза и синаптическая пластичность гиппокампа белых крыс после окклюзии общих сонных артерий // Сибирский медицинский журнал. 2018. Т. 33, № 3. С. 102-110. doi: https://doi.org/10.29001/2073-8552-2018-33-3-102-110
- Наумов Н. Г., Дробленков А. В. Реактивные изменения клеток паранигрального ядра среднего мозга в условиях переднемозговой ишемии у крыс // Морфология. 2014. Т. 145, вып. 3. С. 137-138.
- Степанов А. С., Авдеев Д. Б., Акулинин В. А., Степанов С. С. Структурно-функциональные изменения нейронов неокортекса белых крыс после 20-минутной окклюзии общих сонных артерий // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2018. Т. 62, № 2. С. 30-38. doi: https://doi. org/10.25557/0031-2991.2018.02.30-38
- Степанов А. С., Акулинин В. А., Степанов С. С., Авдеев Д. Б., Горбунова А. В. Коммуникация нейронов поля CA3 гиппокампа головного мозга белых крыс после острой ишемии // Общая реаниматология. 2018. Т. 14, № 5. С. 38-49. doi: https://doi.org/10.15360/1813-9779-2018-5-38-49
- Яковлев А. А., Гуляева Н. В. Плейотропные функции протеиназ мозга: методические подходы к исследованию и поиск субстратов каспазы // Биохимия. 2011. Т. 76, № 10. С. 1325-1334. doi: https://doi.org/10.1134/ s0006297911100014
- Яковлев А. А., Гуляева Н. В. Прекондиционирование клеток мозга к патологическим воздействиям: вовлеченность протеаз (обзор) // Биохимия. 2015. Т. 80, № 2. С. 204-213.
- Khalil H., Peltzer N., Walicki J. et al. Caspase 3 protects stressed organs against cell death // Mol. Cell. Biol. 2012. Vol. 32, № 22. P. 4523-4533. doi: 10.1128/mcb.00774-12
- Launay S., Hermine O., Fontenay M. et al. Vital functions for lethal caspases // Oncogene. 2005. Vol. 24, № 33. P. 5137- 5148. doi: 10.1038/sj.onc.1208524
- McLaughlin B., Hartnett K. A., Erhardt J. A. et al. Caspase 3 acti vation is essential for neuroprotection in preconditioning // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. Vol. 100, № 2. P. 715-720. doi: 10.1073/pnas.0232966100
- Muller G. J., Stadelmann C., Bastholm L. et al. Ischemia leads to apoptosis-and necrosis-like neuron death in the ischemic rat hippocampus // Brain Pathol. 2004. Vol. 14. Iss. 4. P. 415-424. doi: 10.1111/j.1750-3639.2004.tb00085.x
- Paxinos G., Watson C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 5th ed. San Diego, CA: Elsevier Academic Press, 2005. 367 p.
- Winkelmann E. R., Charcansky A., Faccioni-Heuser M. C. et al. An ultrastructural analysis of cellular death in the CA1 field in the rat hippocampus after transient forebrain ischemia followed by 2, 4 and 10 days of reperfusion // Anat. Embryol. (Berl.) 2006. Vol. 211. Iss. 5. P. 423-434. doi: 10.1007/s00429-006-0095-z
- Zeng Y. S., Xu Z. C. Co-existence of necrosis and apoptosis in rat hippocampus following transient forebrain ischemia // Neurosci. Res. 2000. Vol. 37. Iss. 2. P. 113-125. doi: 10.1016/s0168-0102(00)00107-3