IMMUNOHISTOCHEMICAL DEMONSTRATION OF APOPTOSIS AND NEUROPLASTICITY IN THE CEREBRAL CORTEX OF ALBINO RAT AFTER OCCLUSION OF THE COMMON CAROTID ARTERIES



Cite item

Full Text

Abstract

Objective - to study the activity of the apoptotic proteins (bcl-2, p53, caspase-3) and neuroplasticity (p38, MAP-2) of the sensorimotor cortex (SMC) of the brain of intact albino rats, and at different times after a 20-minute occlusion of common carotid arteries (CCAO). Materials and methods. Light microscopy (staining with hematoxylin and eosin), immunohistochemistry and morphometry were applied. Material for the study: control group (sham-operated animals, n=5), main group (animals 1, 3, 7, 14, 30 days after the CCAO, n=25). Results. It was demonstrated that after CCAO, when an irreversible destruction of part of SMC neurons occurred (layer III - 21,5 %, V - 19,0 %), the processes (MAP-2) and synapses (p38) of the surviving neurons were reorganized. The relative labelling ratio of antibodies to p38 and caspase-3 localized in synaptic terminals was first reduced (on the 1st and 3rd day), and then restored (on the 7th day). In the dynamics of the, The most pronounced changes in caspase-3 during the postischemic period were observed after 7, 14, and 30 days, when its content exceeded the content of p38. Discussion. Post-ischemic compensatory reorganization of the neuron communication system (processes, synapses) is associated with a high content of caspase-3 in axons. No manifestations of apoptosis (activation of caspase-3 in the pericarion) were detected. Conclusions. Caspase-3 must be considered in terms of its pleiotropy, participation in adaptation and recovery processes - neuroplasticity.

Full Text

Введение. Известно, что после острой ишемии запускаются механизмы повреждения нервной ткани путем некроза и апоптоза, а также нейропластичность [2, 12, 13]. Необратимые повреждения нейронов при острой ишемии инициируются через активацию c-Jun N-terminal kinase (JNK). Затем следует апоптоз или вторичный (отдаленный) некроз [10]. При этом активную роль играет каспаза-3, которая обладает как про-, так и антиапоптотическим свойством [5, 6]. Нейропротекторная и нейропластическая функции каспазы-3 могут быть активированы Ca2+-зависимым путем, но точные механизмы пока неизвестны [7-9]. Вероятно, апоптотические протеиназы имеют функции, непосредственно связанные с нейропластичностью. Каспазе-3 присуща плейотропия или мультимодальность, что реализуется в вовлечении этого фермента во множество различных прямо противоположных функций. При развитии церебральной патологии этот фермент опосредует как гибель нервных клеток, так и компенсаторные процессы, необходимые для выживания нейронов и нормального функционирования мозга в целом [7, 8]. Морфологических исследований нервной ткани в этом направлении мало. Ключевыми структурами, связанными с активацией механизмов нейропластичности, являются межнейронные синапсы и нервные отростки [3, 4]. Современные методы иммуногистохимии позволяют выявить эти структуры даже на светооптическом уровне, например, с помощью верификации синаптофизина (терминали - пресинаптическая зона) и МАР-2 (дендриты - постсинаптическая зона) [1, 4]. Ранее мы продемонстрировали ультраструктурные и иммуногистохимические признаки вероятной связи каспазы-3 и синаптической пластичности в гиппокампе белых крыс, перенесших ООСА [1]. Данных о подобном исследовании коры головного мозга крыс в литературе мы не нашли. Целью настоящего исследования явилось иммуногистохимическое изучение сенсомоторной коры (СМК) головного мозга белых крыс в контроле и после 20-минутной ООСА для выявления связи нейропластичности и активности каспазы-3, как одного из ключевых ферментов апоптоза. Материал и методы. Эксперименты проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. № 755) и с рекомендациями Международного комитета по науке о лабораторных животных, поддержанных ВОЗ, директивой Европейского Парламента № 2010/63/EU от 22.09.2010 г. «О защите животных, используемых для научных целей». На проведение исследования было получено разрешение этического комитета ФГБОУ ВО «Омский государственный медицинский университет» (протокол № 83 от 14 октября 2016 г). Работа выполнена на 30 самцах белых крыс Wistar массой 180-200 г, которых содержали в конвенциональном виварии. Животных выводили из эксперимента путем декапитации. 20-минутную ООСА (2-сосудистая модель неполной глобальной ишемии без гипотонии) воспроизводили на фоне премедикации (сульфат атропина 0,1 мг/кг подкожно) и общей анестезии (Zoletil 100 10 мг/кг). Взятие материала проводили через 1 (n=5), 3 (n=5), 7 (n=5), 14 (n=5) и 30 (n=5) сут после ООСА. Группой сравнения служили ложнооперированные (без окклюзии артерий) животные того же возраста через 3 сут после ложной операции (n=5). Головной мозг фиксировали перфузией 4 % раствора параформальдегида на 0,1М фосфатном буфере (рН 7,4) через восходящую часть дуги аорты. Серийные фронтальные срезы (толщина 4 мкм) сенсомоторной коры [11] окрашивали гематоксилином - эозином. Для иммуногистохимического исследования использовали моноклональные мышиные антитела к Caspase-3 (CPP32 - активная форма; код NCL-CPP32, клон JHM62), bcl-2 (код PA0117, клон 3.1), р38 (код ORG-8848, клон 27G12), p53 (код PA0057, клон DO-7) (Лейка Биосистемс Ньюкасл Лтд, Соединенное Королевство) и поликлональные кроличьи антитела к MAP2 (ab32454) (Abcam, США). После реакции с первичными антителами срезы последовательно инкубировали с вторичными антителами, затем с хромогеном DAB (3,3’-диаминобензидин), докрашивали гематоксилином и заключали в полистирол. На микроскопе Leica DM 1000 делали цифровые микрофотографии (по 80 полей зрения с каждого срока), изображение сохраняли в файлах с расширением tiff (2592×1944 пикселей). Для достижения максимальной контрастности и четкости мелких отростков нейронов в Photoshop CC проводили коррекцию изображения с помощью фильтра Camera Raw (контрастность, баланс белого, четкость). Дальнейшее морфометрическое исследование осуществляли на масках 8-битовых черно-белых изображений (об. 40) с использованием программы Image J 1.52. Определяли общую численную плотность нейронов, относительную площадь р38-и каспаза-3-позитивного материала. Проверку статистических гипотез осуществляли непараметрическими критериями Манна-Уитни, ANOVA (однофакторный дисперсионный анализ) Краскела-Уоллиса (StatSoft Statistica 8.0). Результаты представлены как медиана (нижний и верхний квартили). В ходе проведения статистического анализа нулевая гипотеза отвергалась при p≤0,05. Результаты исследования. Гистопатологические изменения в СМК через 1 сут после ООСА показали, что патогномоничным и доминирующим маркером последствий ишемии-реперфузии является появление нейронов с ишемическим повреждением (тёмноокрашенных клеток с гиперхроматозом ядер), находящихся на разных стадиях патологического процесса (несморщенные и пикноморфные без и с гомогенизацией хроматина), которые длительно сохраняются в постишемическом периоде (рис. 1, а, б). Содержание нормохромных нейронов (их численная плотность) через 3 сут после ООСА статистически значимо уменьшалось в слое III в 1,6-7,9 раза, а в слое V - в 2,8-3,9 раза (p<0,05). В отдаленном периоде (на 30-е сутки) отмечались небольшие скопления темных сморщенных нейронов. Это свидетельствует о том, что после 20-минутной ООСА бóльшая часть гиперхромных ишемических нейронов не подвергаются необратимой деструкции и фагоцитозу, а сохраняются в течение всего периода наблюдения. Через 30 сут в слое III дефицит общей численной плотности нейронов составил 21,5 %, а в слое V - 19,0 %. Сохранившиеся нормохромные нейроны имели гипертрофированные тела. Вероятно, именно за счет подобных нейронов осуществляется реорганизация нейронных сетей в СМК. По данным иммуногистохимического исследования, после ООСА белки регуляции апоптоза (р53, bcl-2) выявляются в единичных нейронах СМК. Каспаза-3 имеет высокую активность только в аксонах и синаптических терминалях, а в перикарионах не выявляется. Мы полагаем, что при 20-минутной ООСА апоптоз не имеет существенного значения для элиминации поврежденных нейронов. Каспазу-3 в данном случае целесообразно рассматривать в аспекте ее плейотропии и участия в механизмах нейропластичности. Исследование также показало, что локализация каспазы-3 в СМК соответствует таковой р38 - в стратегических зонах реализации механизмов синаптической пластичности (терминали аксошипиковых, аксодендритических и аксосоматических синапсов). Подобная локализация наблюдается в течение всего периода наблюдения, изменяется только плотность распределения маркера каспазы-3 ир38 между дендритами (МАР-2) (рис. 2, а-в; 3, а-г). Математическая обработка полученных данных показала, что в постишемическом периоде происходит статистически значимое (ANOVA Краскела-Уоллиса, p<0,05) изменение относительной площади (ОП) отростков нейронов (MAP-2-позитивные структуры) в поле зрения. Установлено, что в молекулярном слое СМК у животных контрольной группы ОП отростков в нейропиле составляет 28,6 (24,4-32,5) %. У животных основной группы ОП сначала (1-3 сут) снижается до 21,1 (13,5-23,2) %, затем к 7-м суткам восстанавливается до уровня контроля - 25,6 (21,5-29,9) %, а в отдаленном периоде (14 и 30 сут) превышает контрольное значение - 34,8 (28,5-36,3) и 39,7 (31,4-46,2) % (критерий Манна-Уитни, p<0,05). Это свидетельствует о небольшом, но значимом изменении содержания белка MAP-2, связанном с цитоскелетом нейронов, в ответ на ООСА. Уменьшение содержания этого белка через 1 и 3 сут, вероятно, обусловлено деструкцией цитоскелета. Увеличение содержания MAP-2 в отдаленном периоде можно рассматривать как одно из проявлений нейропластичности - компенсаторной реорганизации отростков сохранившихся нейронов путем гипертрофии (утолщение, удлинение, разветвление). На фоне постишемической реорганизации дендритов и аксонов в СМК происходит изменение ОП меток р38 и каспазы-3 (таблица). В остром периоде (1 и 3 сут) ОП меток р38 и каспазы-3 снижается, вероятно, в результате разрушения синаптических терминалей. Затем, на 7-е сутки этот показатель для р38 восстанавливается до контрольного уровня, а для каспазы-3 - статистически значимо превышает контрольное значение. В отдаленном периоде (14 и 30 сут) ОП каспазы-3 превышает как контрольное значение, так и ОП р38 (см. таблицу). Обсуждение полученных данных. Таким образом, компенсаторная реорганизация отростков нейронов (MAP-2) и синапсов (p38) через 7, 14 и 30 сут после ООСА происходит на фоне высокого содержания каспазы-3 в аксонных терминалях. В норме относительная площадь меток каспазы-3 в СМК статистически значимо не отличается от таковой р38. Использованные нами моноклональные мышиные антитела (CPP32) выявляют активную форму caspase-3 - члена семейства аспартатспецифических цистеиновых протеаз, одного из основных медиаторов клеточного апоптоза. Ее активация происходит на ранних стадиях апоптоза путем самопротеолиза и/или за счет воздействия других протеаз. Однако в последнее время каспаза-3 рассматривается не только как ключевой фермент конечной стадии апоптоза, но и как важный химический компонент нейропластичности [5, 7, 8]. Кроме того, локализация неапоптотической формы этой протеазы совпадает с местами максимального проявления процессов нейропластичности - аксонами и синаптическими терминалями [1, 5, 6]. Наиболее подходящей моделью острой ишемии для проверки этого положения является 20-минутная окклюзия общих сонных артерий, после которой, как правило, возникают умеренные диффузные изменения нервной ткани без очагов некроза [2-4]. С помощью иммуногистохимии нам не удалось показать активацию белков р53 и bcl-2. Кроме того, каспаза-3 в норме и после ООСА была выявлена только в аксонах и синаптических терминалях, а в телах нейронов этот белок отсутствовал. Наличие артефактов окраски нервной ткани в нашем исследовании исключается в силу высокой специфичности меток (окраска только терминалей и аксонов). Все это свидетельствует об отсутствии иммуногистохимических проявлений апоптоза в телах нейронов. При этом в постишемическом периоде количество синаптофизина восстанавливается на фоне высокого относительно контроля содержания каспазы-3 в синаптических терминалях, т. е., по нашим данным, для нейронов СМК при использованной модели ООСА весьма вероятно проявление неапоптотических (плейотропных) нейропротекторных и нейропластических эффектов каспазы-3 без каких-либо признаков ее активации в перикарионе, что необходимо для завершения конечной стадии апоптоза. Заключение. Многообразие функций каспазы-3 широко обсуждается [5, 6], но абсолютное подтверждение ее участия в нейропластичности требует дальнейших молекулярных исследований лигандов этого фермента. Данная работа выполнена при поддержке Фонда содействия инновациям по программе «УМНИК» № 14 от 15.12.2017 г. и внутреннего гранта ФГБОУ ВО «Омского государственного медицинского университета» № 574 от 24.11.2017 г. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: Д. Б. А., С. С. С., А. В. Г., В. А. А., А. Ю. Ш. Сбор и обработка материала: Д. Б. А., С. С. С., А. В. Г., В. А. А., А. Ю. Ш. Статистическая обработка данных: Д. Б. А., С. С. С., А. В. Г., В. А. А., А. Ю. Ш. Анализ и интерпретация данных: Д. Б. А., С. С. С., А. В. Г., В. А. А., А. Ю. Ш. Написание текста: Д. Б. А., С. С. С., А. В. Г., В. А. А., А. Ю. Ш. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.
×

About the authors

D. B. Avdeev

Omsk State Medical University

Email: avdeev86@inbox.ru
12 Lenina St., Omsk 644099

S. S. Stepanov

Omsk State Medical University

Email: serg_stepanov@mail.ru
12 Lenina St., Omsk 644099

A. V. Gorbunova

Omsk State Medical University

Email: double_energy@mail.ru
12 Lenina St., Omsk 644099

V. A. Akulinin

Omsk State Medical University

Email: akulinin@omsk-osma.ru
12 Lenina St., Omsk 644099

A. Yu. Shoronova

Omsk State Medical University

Email: nastasya1994@mail.ru
12 Lenina St., Omsk 644099

References

  1. Авдеев Д. Б.,Акулинин В. А.,Степанов А. С.,Горбунова А. В., Степанов С. С. Плейотропные ферменты апоптоза и синаптическая пластичность гиппокампа белых крыс после окклюзии общих сонных артерий // Сибирский медицинский журнал. 2018. Т. 33, № 3. С. 102-110. doi: https://doi.org/10.29001/2073-8552-2018-33-3-102-110
  2. Наумов Н. Г., Дробленков А. В. Реактивные изменения клеток паранигрального ядра среднего мозга в условиях переднемозговой ишемии у крыс // Морфология. 2014. Т. 145, вып. 3. С. 137-138.
  3. Степанов А. С., Авдеев Д. Б., Акулинин В. А., Степанов С. С. Структурно-функциональные изменения нейронов неокортекса белых крыс после 20-минутной окклюзии общих сонных артерий // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2018. Т. 62, № 2. С. 30-38. doi: https://doi. org/10.25557/0031-2991.2018.02.30-38
  4. Степанов А. С., Акулинин В. А., Степанов С. С., Авдеев Д. Б., Горбунова А. В. Коммуникация нейронов поля CA3 гиппокампа головного мозга белых крыс после острой ишемии // Общая реаниматология. 2018. Т. 14, № 5. С. 38-49. doi: https://doi.org/10.15360/1813-9779-2018-5-38-49
  5. Яковлев А. А., Гуляева Н. В. Плейотропные функции протеиназ мозга: методические подходы к исследованию и поиск субстратов каспазы // Биохимия. 2011. Т. 76, № 10. С. 1325-1334. doi: https://doi.org/10.1134/ s0006297911100014
  6. Яковлев А. А., Гуляева Н. В. Прекондиционирование клеток мозга к патологическим воздействиям: вовлеченность протеаз (обзор) // Биохимия. 2015. Т. 80, № 2. С. 204-213.
  7. Khalil H., Peltzer N., Walicki J. et al. Caspase 3 protects stressed organs against cell death // Mol. Cell. Biol. 2012. Vol. 32, № 22. P. 4523-4533. doi: 10.1128/mcb.00774-12
  8. Launay S., Hermine O., Fontenay M. et al. Vital functions for lethal caspases // Oncogene. 2005. Vol. 24, № 33. P. 5137- 5148. doi: 10.1038/sj.onc.1208524
  9. McLaughlin B., Hartnett K. A., Erhardt J. A. et al. Caspase 3 acti vation is essential for neuroprotection in preconditioning // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. Vol. 100, № 2. P. 715-720. doi: 10.1073/pnas.0232966100
  10. Muller G. J., Stadelmann C., Bastholm L. et al. Ischemia leads to apoptosis-and necrosis-like neuron death in the ischemic rat hippocampus // Brain Pathol. 2004. Vol. 14. Iss. 4. P. 415-424. doi: 10.1111/j.1750-3639.2004.tb00085.x
  11. Paxinos G., Watson C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 5th ed. San Diego, CA: Elsevier Academic Press, 2005. 367 p.
  12. Winkelmann E. R., Charcansky A., Faccioni-Heuser M. C. et al. An ultrastructural analysis of cellular death in the CA1 field in the rat hippocampus after transient forebrain ischemia followed by 2, 4 and 10 days of reperfusion // Anat. Embryol. (Berl.) 2006. Vol. 211. Iss. 5. P. 423-434. doi: 10.1007/s00429-006-0095-z
  13. Zeng Y. S., Xu Z. C. Co-existence of necrosis and apoptosis in rat hippocampus following transient forebrain ischemia // Neurosci. Res. 2000. Vol. 37. Iss. 2. P. 113-125. doi: 10.1016/s0168-0102(00)00107-3

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) 2019 Avdeev D.B., Stepanov S.S., Gorbunova A.V., Akulinin V.A., Shoronova A.Y.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: № 0110212 от 08.02.1993.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies