MELANIN IN THE PINEAL GLANDS OF CANIDAE

Full Text

Введение. Меланин - это эндогенный ным преобразователем информации об освещёнмелкодисперсный коричнево-чёрный пигмент, ности в гормональный сигнал, а именно, повышая который образуется в меланоцитах при окисле-уровень своего основного продукта - гормонии тирозина до дигидроксифенилаланина, ката-на мелатонина - в тёмное время суток/ года, лизирует реакцию фермент тирозиназа. Хорошо железа участвует в регуляции суточного ритма известна защитная функция эпителиального мела-и сезонных изменений физиологических функций нина, однако, у позвоночных пигмент также может животных [1]. накапливаться во внутренних органах, участвуя Наличие меланина в ШЖ было описано у грыв их развитии и функционировании, а также зунов [5, 6], зайцеобразных [11], парнокопытных выполняя защитную функцию при окислитель-[13, 14], непарнокопытных [9], хищных [7, 8], ном стрессе, гипоксии, ультрафиолетовом облу-рукокрылых [2], а также у человека [12]. В этих чении и нагрузке поллютантами [10]. работах среди возможных причин пигментации Особый интерес представляет исследование ШЖ рассматриваются особенности ее строения накопления меланина в шишковидной железе и развития в зависимости от возраста, пола, ста(ШЖ) млекопитающих. Являясь нейроэндокрин-дии полового цикла, а также в условиях полной темноты, однако результаты этих исследований противоречивы. В настоящее время причины накопления пигмента в ШЖ и его физиологическое значение до конца не ясны. В связи со слабой изученностью этого вопроса является актуальным продолжение подобных исследований у других видов млекопитающих, в том числе близкородственных видов семейства Canidae (Carnivora) - енотовидной собаки, лисицы и песца. Это моноэстричные, сезонно размножающиеся животные, которые становятся половозрелыми в 9-11 мес, их максимальная продуктивность приходится примерно на 3-летний возраст. Сведения о строении ШЖ у этих видов в доступной литературе скудны или отсутствуют и не содержат какой-либо информации о возможном присутствии меланина [4]. Целью исследования - изучить наличие меланина в ШЖ, а также оценить частоту встречаемости пигментированных желёз у неполовозрелых и взрослых особей трёх видов млекопитающих семейства Canidae - енотовидной собаки, лисицы и песца. Материал и методы. Исследование выполнено на оборудовании Центра коллективного пользования ФИЦ «Карельский научный центр Российской академии наук» с разрешения этического комитета ИБ КарНЦ РАН (протокол № 1 от 15.01.2018 г.) и с соблюдением международных принципов Директивы Евросоюза 2010/63/EU о гуманном отношении к экспериментальным животным. Объектами исследования явились самки представителей семейства Canidae: енотовидная собака (Nyctereutes procyonoides Grey), лисица (Vulpes vulpes L.) и песец (V. Lagopus L.), разводимые в условиях звероводческой фермы. Животные получали рацион согласно рекомендациям для этих видов и воду ad libitum. Эксперимент проводился в декабре, когда звери находились в состоянии репродуктивного покоя. Шишковидные железы от 2 групп животных каждого вида разных возрастов - неполовозрелые, или ювенильные (6-8 мес), и половозрелые (1,5-3,5 лет) - извлекали, подсчитывали доли (%) непигментированных и пигментированных, затем анализировали с помощью гистологических методов. Число неполовозрелых и взрослых животных каждого вида было следующим: енотовидной собаки (n=4, n=15), лисицы (n=15, n=28) и песца (n=14, n=14 соответственно). ШЖ фиксировали в 10 % забуференном растворе формальдегида при комнатной температуре, затем обезвоживали в спиртах восходящей концентрации с последующим приготовлением парафиновых срезов толщиной 0,5-0,8 мкм. Морфологические особенности ШЖ изучали на срезах, окрашенных гематоксилином - эозином, а также по Массону- Фонтана для выявления меланина. Депигментация контрольных срезов проведена с помощью отбеливателя Маллори до импрегнации серебром. Препараты впоследствии изучались с использованием светового микроскопа AxioScope. A1 (Zeiss, Германия). Статистическая обработка данных включала дисперсионный анализ (одно-и многофакторный ANOVA) и критерий χ2, статистически значимыми считали различия при p<0,05. Результаты исследования. Шишковидная железа является частью эпиталамуса промежуточного мозга и располагается в углублении между двумя передними холмиками пластинки четверохолмия среднего мозга вблизи от III желудочка мозга. Согласно классификации [15], ШЖ псовых относится к типу А или АВ. Её цвет варьирует от светло-серого до розового. Форма может быть округлой или конической. Снаружи железа покрыта пиальной капсулой. В паренхиме доминируют пинеалоциты, также видны глиальные клетки, кровеносные сосуды, пигменты. У трёх видов псовых, наряду с железами обычного светлого цвета, были обнаружены эпифизы, в которых пигментация затрагивала либо отдельную область, чаще - вентральную поверхность дистальной части или правую половину, либо целую железу (рис.1). Визуально ШЖ подразделяли на непигментированные и пигментированные. При исследовании срезов непигментированных желёз были отмечены единичные очаги скопления пигментных гранул, в основном на периферии дистальной части под капсулой, тогда как в паренхиме они располагались хаотично (рис. 2, а). На срезах пигментированных желёз обнаружены массивные скопления округлых тёмно-коричневых пигментных гранул разного размера, которые обволакивали ядро или заполняли отростки клеток (см. рис. 2, б-е). Клетки, содержащие пигмент, располагались преимущественно возле кровеносных сосудов. Гистохимический анализ показал, что пигмент является меланином. Это подтверждалось наличием аргентаффинной реакции при окраске по Массону-Фонтана (см. рис. 2, г). Среди особей енотовидных собак пигментация железы выявлена только в одном случае - у неполовозрелого зверя. Среди лисиц, напротив, пигментированные ШЖ выявлялись исключительно у взрослых животных в 21,4 % случаев. Среди песцов этот показатель снижался с возрастом с 21,4 до 7,1 %. Многофакторный ANOVA показал значимое совместное влияние факторов видовой принадлежности и возраста на частоту встречаемости пигментированных ШЖ (df=2; F=3,76; p<0,05). По данным однофакторного ANOVA, фактор возраста оказывал влияние на исследуемый показатель только у енотовидных собак, тогда как критерий χ2 показал значимое влияние возраста у всех исследованных видов (таблица). Обсуждение полученных данных. Результаты исследований морфологических особенностей ШЖ у млекопитающих противоречивы: одни исследователи отмечают наличие в ней меланина [2, 5-9, 11-14], другие - нет [3]. В визуально непигментированных эпифизах исследованных нами видов животных гранулы меланина встречались в небольшом количестве и в основном на периферии дистальной части железы, под капсулой. Среди представителей семейства псовых пинеальный меланин был выявлен ранее только у собак [7]. Наряду с этим, считается, что лошади и крупный рогатый скот способны накапливать в своих ШЖ значительное количество пигмента [9, 14]. Результаты нашего исследования позволяют дополнить список видов млекопитающих, характеризующихся интенсивно пигментированными ШЖ. Нами была зафиксирована большая вариабельность пигментации ШЖ у изученных видов псовых, что согласуется с данными, полученными не только на собаках, но и на летучих мышах [2]. Пигментированные участки чаще всего располагались на вентральной поверхности дистальной части органа либо на правой половине железы. У кошки пигментные клетки также обнаружены преимущественно на вентральной поверхности дистальной части железы [8], у собаки, напротив, - в проксимальной части возле задней спайки [7]. Эти межвидовые различия, вероятно, обусловлены расположением предшественников пигментных клеток во время эмбрионального развития у разных видов. На срезах пигментированных желёз псовых массивные скопления округлых тёмнокоричневых пигментных гранул разного размера, обволакивающие ядро и/или заполняющие отростки клеток, находились преимущественно возле кровеносных сосудов, что согласуется с данными, полученными другими исследователями [6, 14]. У крупного рогатого скота наружная оболочка большинства кровеносных сосудов ШЖ была обильно покрыта массами меланина, в интенсивно окрашенных областях пигмент проникал через эндотелиальные клетки в кровеносные сосуды [14]. Несмотря на то, что меланогенез происходит в меланоцитах, пинеалоциты и интерстициальные клетки также могут содержать его небольшое количество, по всей вероятности, в результате трансфера меланосом [2, 8]. Причины накопления и биологическое значение пигмента в ШЖ до конца не ясны. Среди факторов, ответственных за пигментацию ШЖ, рассматривают особенности её развития и строения [1, 2, 14], в том числе гомологию железы и пигментного эпителия сетчатки глаза. На пигментацию железы также может оказывать влияние функциональная взаимосвязь между ШЖ и другими эндокринными железами. Полагают [12], что вследствие ингибирующего дей-Учитывая регуляторное действие ШЖ ствия мелатонина на высвобождение меланоцит-на половую функцию млекопитающих, принадстимулирующего гормона из гипофиза экзоци-лежность и(или) изменения репродуктивного статоз гранул меланина из цитоплазмы прекращает-туса организма, вероятно, могут оказывать влияся, и пигмент накапливается в клетках эпифиза. ние на ее пигментацию. Пинеальный меланин был обнаружен у неполовозрелых овец, но отсутствовал у особей в пубертатном и постпубертатном периодах [13]. Самки вискачи характеризовались бóльшим числом пигментных клеток по сравнению с самцами, причём в период беременности этот показатель возрастал [5, 6]. Неоднозначные результаты были получены E. Santamarina [14], который обнаружил пигментированные железы в 67 % случаев у бычков, в 49,6 % - у кастратов в возрасте 1,5-2 лет, в 8,5 и 5,4 % случаев - у небеременных и беременных коров соответственно, тогда как у телят в возрасте 1,5 лет и у быков в возрасте 4-5 лет пигмент в эпифизе зафиксирован не был. Тем не менее, другие исследователи считают присутствие меланина в ШЖ постоянной характеристикой [7, 8] и не обнаруживают связи между количеством пигмента и возрастом [2, 7, 9], полом [2, 7, 12] или репродуктивным статусом [7]. Высказывается мнение, что, скорее всего, количество пигментных клеток не связано ни со зрелостью железы, ни с половым созреванием [7], поскольку пигмент обнаруживается на эмбриональной стадии развития [11], когда паренхима железы содержит незрелые пролиферирующие клетки. В ходе нашего исследования показано значимое влияние возраста и видовой принадлежности на частоту встречаемости пигментированных желёз у псовых. Так, если у енотовидных собак пигментация эпифиза обнаружена только у ювенильных особей (25 %), у лисиц - только у половозрелых животных (21,4 %), то для песцов пигментированные органы были характерны для обеих возрастных групп, но с возрастом их доля снижалась (с 21,4 до 7,1 %). Заключение. В мозгу представителей семейства псовых зафиксирована большая вариабельность пигментации шишковидной железы: от непигментированных до интенсивно пигментированных. Частота встречаемости пигментированных желёз у этих животных характеризуется видоспецифичностью и зависит от возраста. Поскольку причины накопления и биологическое значение меланина в ШЖ млекопитающих ясны не до конца, существует необходимость в дальнейших исследованиях этого вопроса. Благодарности Финансовое обеспечение исследований осуществлялось из средств федерального бюджета на выполнение государственного задания КарНЦ РАН (0218-2019-0073). Авторы выражают глубокую благодарность сотрудникам ИБ КарНЦ РАН канд. биол. наук Е. А. Хижкину и А. В. Морозову, работникам ЗАО «Пряжинское», ФГУП «Русский соболь» (лично селекционеру канд. биол. наук З. С. Ручкиной) и ООО «Зверохозяйство „Вятка”» за помощь при работе с животными. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: С. Н. К., В. А. И. Сбор и обработка материала: С. Н. К., Е. П. А., Е. С. Б., И. И. О. Статистическая обработка данных: С. Н. К., В. А. И. Анализ и интерпретация данных: С. Н. К., В. А. И., Л. Б. У. Написание текста: С. Н. К., В. А. И., Л. Б. У. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

About the authors

S. N. Kalinina

Karelian Research Centre of the Russian Academy of Sciences

Email: cvetnick@yandex.ru
Laboratory of Animal Ecological Physiology, Institute of Biology 11 Pushkinskaya St., Petrozavodsk 185910

V. A. Ilyukha

Karelian Research Centre of the Russian Academy of Sciences

Laboratory of Animal Ecological Physiology, Institute of Biology 11 Pushkinskaya St., Petrozavodsk 185910

L. B. Uzenbaeva

Karelian Research Centre of the Russian Academy of Sciences

Laboratory of Animal Ecological Physiology, Institute of Biology 11 Pushkinskaya St., Petrozavodsk 185910

Ye. P. Antonova

Karelian Research Centre of the Russian Academy of Sciences

Laboratory of Animal Ecological Physiology, Institute of Biology 11 Pushkinskaya St., Petrozavodsk 185910

Ye. S. Bruler

Petrozavodsk State University

Institute of Biology, Ecology and Agrotechnology 33 Lenina Pr., Petrozavodsk 185910

I. I. Okulova

prof. B. M. Zhitkov Russian Game Management and Fur Farming Research Institute

Veterinary Department 79 Preobrazhenskaya St., Kirov 610000

References

Supplementary files