POSTNATAL DEVELOPMENT OF GABAERGIC NEURONS IN RAT CEREBELLUM

Full Text

Введение. Основным нейромедиатором торможения в мозжечке является гаммааминомасляная кислота (ГАМК). Из 7 основных типов нейронов коры мозжечка 5 являются ГАМК-ергическими. Все ГАМК-ергические нейроны коры и ядер мозжечка образуются из нейроэпителия IV желудочка, а затем мигрируют, занимают свое дефинитивное положение и дифференцируются [14, 15]. Предшественники корзинчатых нейронов у крыс образуются на 2-17-е сутки, а звездчатых нейронов - на 4-19-е сутки постнатального развития. Они достигают своего конечного положения в молекулярном слое на 7-21-е сутки после рождения [14, 15], дифференцируются и устанавливают ГАМК-ергические синаптические контакты с грушевидными нейронами (клетками Пуркинье, КП). Предшественники КП у крыс образуются на 13-16-е сутки эмбриогенеза [4]. Постмиграционные КП в коре мозжечка с 19-х суток внутриутробного развития по 6-е сутки после рождения осуществляют ремоделирование дендритов, а затем с 7-х по 30-е сутки - рост обширного дендритного дерева. КП обеспечивают выход информации из коры, образуя большинство ГАМКергических синапсов на нейронах ядер мозжечка. В зернистом слое располагаются ГАМКергические биполярные веретеновидные нейроны (клетки Лугаро, КЛ) и большие звездчатые нейроны (клетки Гольджи, КГ). КЛ начинают формироваться на 14-15-е сутки внутриутробного развития. Они образуют ГАМК-ергические синапсы, ингибирующие КГ, корзинчатые, звездчатые нейроны [11] и КП [6]. КГ образуются с 18-х суток эмбриогенеза по 2-е сутки постнатального онтогенеза. Аксоны КГ ветвятся в зернистом слое, входят в состав клубочков мозжечка и подавляют активность зерновидных нейронов (ЗН) с помощью ГАМК [5]. По электрофизиологическим, морфологическим и биохимическим свойствам различают пять типов нейронов в ядрах мозжечка, из которых два типа являются ГАМК-ергическими [12]. Таким образом, ГАМК-ергические нейроны в коре и ядрах мозжечка у эмбрионов и взрослых крыс достаточно хорошо изучены, но о динамике постнатального развития этих нейронов известно недостаточно, что необходимо для понимания постнатального морфогенеза и становления функций мозжечка. ГАМК образуется путем декарбоксилирования глутаминовой кислоты ферментом глутаматдекарбоксилазой (ГДК) [3]. ГДК синтезируется в телах ГАМК-ергических нейронов, а затем транспортируется вдоль аксона в терминали, где участвует в образовании ГАМК. ГДК экспрессируется только в нейронах, которые используют ГАМК как нейромедиатор [8], и поэтому служит хорошим маркером ГАМКергических нейронов в ЦНС [1]. Целью настоящего исследования была оценка динамики формирования ГАМК-ергических нейронов в развивающемся мозжечке крысы с помощью иммуногистохимического выявления ГДК Материал и методы. Эксперименты выполнены на потомстве самок беспородных белых крыс с исходной массой 180±20 г. Все опыты проведены с учетом «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». На данное исследование получено разрешение комитета по биомедицинской этике Гродненского государственного медицинского университета (протокол № 7 от 23. 12. 2013 г.). Животные находились на стандартном рационе вивария. От каждой самки брали для исследования по одному крысенку по достижении ими 2, 7, 15 и 45 сут после рождения (всего изучено 16 крысят). Для получения сопоставимых результатов от всех животных образцы околочервячной части мозжечка обрабатывали параллельно и в одинаковых условиях. Их фиксировали в цинк-этанол-формальдегиде при +4 ºС (в течение ночи), затем заливали в парафин. Парафиновые срезы толщиной 7 мкм, проходящие через кору палео-и неоцеребеллума, а также шаровидное и пробковидное ядра мозжечка готовили с помощью микротома Leica RM 2125 RTS (Leica, Германия), монтировали на предметные стекла. Для иммуногистохимического выявления ГДК применяли первичные моноклональные мышиные антитела GAD67 фирмы Abcam (Великобритания, ab. 26116) в разведении 1:2000, экспозиция 20 ч при +4 ºС во влажной камере. Для выявления связавшихся первичных антител использовали набор EXPOSE Mouse and Rabbit specific HRP/DAB detection IHC kit Abcam (Великобритания, ab. 80436). Расположение филогенетически древней (paleocerebellum) и новой (neocerebellum) частей мозжечка крысят на гистологических препаратах определяли по С. Н. Оленеву [2], используя атлас G. Paxinos и C. Watson [10]. Изучение и микрофотографирование гистологических препаратов проводили с помощью микроскопа Axioscop 2 plus (Zeiss, Германия) и цифровой видеокамеры DFC 320 (Leica, Германия). Результаты исследования. На 2-е сутки постнатального развития слои коры мозжечка крысы ещё не сформированы. КП располагаются в 3-4 ряда, ГДК-иммунореактивная цитоплазма их тел представлена лишь узким ободком вокруг ядра. В молекулярном и зернистом слоях выявляются единичные мелкие ГДКиммунопозитивные нейроны. Их тела хорошо выделяются на фоне светлого нейропиля (рис. 1, а). На 7-е сутки КП располагаются в один ряд, ГДКиммунопозитивная цитоплазма их тел увеличивается преимущественно в апикальной части клетки. На 7-е сутки после рождения как в палео- , так и неоцеребеллуме, ГДК-иммунопозитивное окрашивание синапсов появляется на некоторых дендритах и телах КП. В молекулярном и зернистых слоях ГДК-иммунопозитивные нейроны на фоне более темного нейропиля выявляются хуже, чем на 2-е сутки. На телах нейронов молекулярного слоя на 7-е сутки уже четко определяются мелкие ГДК-иммунопозитивные аксосоматические синапсы (см. рис. 1, б). На 15-е сутки равномерное ГДК-иммунопозитивное окрашивание наблюдалось в телах КП вокруг иммунонегативных ядер и в проксимальной части дендритов. Интересно, что дендриты КП в другие сроки исследования так чётко не выявлялись (см. рис. 1). Тело и дендриты многих КП были покрыты переменным количеством ГДК-иммунопозитивных аксосоматических и аксодендритических синапсов. Среди зернистых нейронов определялись мелкие ГДК-иммунопозитивные гранулы, расположенные по периферии формирующихся клубочков мозжечка (см. рис. 1, в). На 45-е сутки ГДК-иммунореактивность выявлялась по всей цитоплазме тел КП, вокруг которых появлялись корзинчатые сплетения из ГДК-позитивных нервных волокон. В молекулярном слое иммунопозитивные по ГДК синапсы становились более мелкими, многочисленными и располагались более равномерно по дендритному дереву КП. ГДКиммунореактивность наблюдалась в телах звездчатых и корзинчатых нейронов, но она была значительно выше в аксонах этих нейронов. ГДКиммунопозитивные гранулы (аксодендритические синапсы) по периферии сформированных клубочков мозжечка становились крупнее (см. рис. 1, г). Ядра мозжечка. На 2-е сутки постнатального онтогенеза крысы в цитоплазме тел некоторых нейронов шаровидного и пробковидного ядер мозжечка выявлялась умеренная ГДК-иммунореактивность. На телах нейронов и в нейропиле ГАМК-ергические синапсы были единичны (рис. 2, а). На 7-е сутки между нейронами начинали выявляться ГДК-иммунопозитивные волокна и ГАМК-ергические аксодендритические синапсы, а на телах нейронов - аксосоматические синапсы (см. рис. 2, б). На 15-е и особенно на 45-е сутки число аксосоматических синапсов ещё больше возрастало. При этом тела большинства нейронов полностью окружаются ГДК-иммунопозитивными ободками. ГДК-иммунореактивность нейропиля также возрастет, за счёт увеличения числа и размеров аксодендритических синапсов (см. рис. 2, в-г). Обсуждение полученных данных. В зрелом мозгу ГАМК функционирует главным образом в качестве тормозного медиатора, а в процессе развития нервной системы она может выступать в качестве трофического фактора, влияя на пролиферацию, миграцию, дифференцировку, созревание синапсов и гибель клеток [9]. Этим можно объяснить выявленную нами экспрессию ГДК в нейронах коры мозжечка уже у двухсуточных крыс еще до начала синаптогенеза. По данным литературы, экспрессия мРНКГДК (гибридизация in situ) в КП достигала уровня взрослых крыс через 1 нед, в КГ - к 14-м суткам постнатального развития [13]. По нашим иммуногистохимическим данным, экспрессия ГДК в этих нейронах также достигала дефинитивного уровня, примерно, в эти же сроки. Наблюдаемое увеличение в молекулярном слое числа ГДК-иммунопозитивных нейронов и ГДК-иммунореактивности нейропиля с 7-х по 45-е сутки может быть связано с увеличением количества ГАМК-ергических звездчатых и корзинчатых нейронов, ростом их отростков и образованием синапсов на растущих дендритах КП. По данным гибридизации in situ, эти нейроны в молекулярном слое достигают конечного содержания мРНК-ГДК к 21-м суткам постнатального развития и позже [13]. Наблюдаемое нами постнатальное увеличение ГДК-иммунореактивности в зернистом слое мозжечка может быть связано с ГАМКергическими нейронами, КГ и КЛ, а также окончаниями аксонов КГ в клубочках мозжечка. В формирующихся нейронах ядер мозжечка крысы, которые образуются ещё пренатально, экспрессия ГДК наблюдалась нами уже на 2-е сутки постнатального онтогенеза, что соответствует литературным данным [7]. Во многих нейронах она сохранялась на 7-45-е сутки. Очень четко и закономерно в ядрах мозжечка в постнатальном онтогенезе увеличиваются количество и размеры аксосоматических и аксодендритических ГАМКергических синапсов, очевидно образованных КП, иммунореактивность аксонов которых отчетливо выявлялась как в нейропиле, так и в белом веществе мозжечка. Заключение. Таким образом, иммуногистохимическое исследование экспрессии глутаматдекарбоксилазы показало определенную динамику постнатального развития ГАМК-ергических нейронов мозжечка крысы. Установлено, что в цитоплазме тел всех типов ГАМК-ергических нейронов мозжечка экспрессия ГДК выявляется уже на 2-е сутки после рождения. В цитоплазме тел КП она достигает максимума на 7-е сутки, а в их дендритах - на 15-е сутки (затем уменьшается), в КГ - на 45-е сутки. ГАМК-ергические синапсы выявляются в коре, а также в шаровидном и пробковидном ядрах мозжечка на 7-е сутки и достигают максимального развития на 45-е сутки после рождения. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: С. М. З. Сбор и обработка материала: О. А. К. Статистическая обработка данных: О. А. К. Написание текста: О. А. К. Редактирование: С. М. З. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

About the authors

S. M. Zimatkin

Grodno State Medical University

Email: smzimatkin@grsmu.by
Department of Histology, Cytology and Embryology 80 Gorkiy St., Grodno 230015, Belarus

O. A. Karniushko

Grodno State Medical University

Email: karnyushko-olga@mail.ru
Department of Histology, Cytology and Embryology 80 Gorkiy St., Grodno 230015, Belarus

References

Supplementary files