REACTIVE CHANGES OF LIVER AND KIDNEY HISTOLOGICAL ELEMENTS IN MURINE MODELS OF SEPSIS CAUSED BY ADMINISTRATION OF DIFFERENT PSEUDOMONAS AERUGINOSA STRAINS TO MICE

Full Text

В экспериментальных исследованиях реактивных морфогенетических изменений органов животных при сепсисе наиболее часто используется его моделирование путем лигирования слепой кишки с микроперфорированием ее стенки [7, 12] либо введением животным липополисахарида - эндотоксина грамотрицательных бактерий [6]. Оптимальной экспериментальной моделью сепсиса, условия которой наиболее близки к механизму его «естественного» развития, является заражение животных патогенными микроорганизмами. Для создания таких экспериментальных моделей целесообразно использовать разные виды и штаммы возбудителей. Потенциально возможные различия в механизмах и эффектах разных видов и штаммов микроорганизмов на клетки и ткани-мишени организма (в первую очередь, почек, печени, легких, функции которых наиболее рано поражаются при сепсисе) позволят не только определить общие морфогенетические критерии сепсиса, но и выявить их специфику, характерную для конкретного вида или штамма возбудителя. Цель исследования - выявить реактивные изменения гистологических элементов печени и почек в экспериментальных моделях сепсиса у мышей, вызванного штаммами 1840 и 1623 Pseudomonas aeruginosa (PsA). Материал и методы. Для моделирования сепсиса использовали половозрелых самцов мышей линии C57Bl/6 массой 18-20 г. Животных распределили на три группы: 1-юи 2-ю - подопытные, 3-ю - контрольную. Мышам 1-й группы (8 особей) однократно интраперитонеально вводили суточную бульонную культуру штамма 1840, выделенного из ожоговой раны человека, в дозе 1×106 КОЕ/мышь и объеме 0,5 мл. Животным 2-й группы (12 особей) однократно вводили суточную бульонную культуру штамма 1623, выделенного из бронхиального смыва больных, находившихся на искусственной вентиляции легких, в объеме 0,5 мл, в дозе 7×106 КОЕ/мышь. Расчет указанных доз возбудителей производили на основе предварительных величин летальных доз (ЛД50) для каждого из штаммов, что соответствует общепринятым правилам экспериментального моделирования сепсиса [2]. Контрольным животным (3 особи) интраперитонеально вводили стерильный изотонический раствор хлорида натрия в объеме 0,5 мл. Перед началом опыта штаммы PsА тестировали на присутствие генов экзотоксинов с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Выделение ДНК проводили, используя комплект реагентов «АмплиПрайм ДНКсорб-АМ» (ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора) согласно протоколу производителя. Структура праймеров и режим амплификации были заимствованы у T. Ajayi и соавт. [3]. Специфичность праймеров контролировали с помощью программы BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). Для обнаружения продуктов ПЦР использовали электрофорез в горизонтальном 1,5 % агарозном геле при постоянном токе (120 В, 400 мА) и комнатной температуре в течение 25 мин. Штаммы PsА культивировали на цитримидном агаре в течение 24 ч при температуре 37 ºС. У штамма 1840 было определено присутствие генов экзотоксинов U (ExoU), T (ExoT), Y (ExoY) и отсутствие гена экзотоксина S (ExoS). У штамма 1623 из четырех генов, характерных для вида PsА (ExoU, ExoS, ExoT, ExoY), присутствовали гены ExoS, ExoT, ExoY и отсутствовал ген ExoU. У животных 1-й группы терминальное состояние наступило через 48 ч, а у животных 2-й группы - через 24 ч после введения возбудителя. Все животные были вскрыты на терминальной стадии под эфирным наркозом. Все манипуляции с животными были выполнены в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1989). Выделенные печень и почки фиксировали 10 % нейтральным формалином, обезвоживали в батарее спиртов восходящей концентрации, заливали в парафиновые блоки. Серийные срезы толщиной 4 мкм окрашивали гематоксилином - эозином, анализировали и фотографировали в световом микроскопе «AxioPlus» (фирма Zeiss, Германия). Результаты исследования. У всех животных 1-й группы реактивные изменения гепатоцитов, как основного клеточного дифферона печени, оказались резко выраженными и однотипными. В паренхиме, наряду с небольшими по величине участками, сохранявшими дольковую гистоархитектуру, находились структурно измененные участки, занимавшие значительную площадь срезов. В одних из таких участков пластинки гепатоцитов сливались в широкие пластинки или печеночные балки без видимых межклеточных границ (рис. 1, а). Многие клетки при этом имели пикнотически измененные ядра и резко вакуолизированную цитоплазму. В других участках на месте печеночных пластинок располагалось гомогенное эозинофильное вещество, содержавшее остатки ядер гепатоцитов и синусоидных капилляров (см. рис. 1, б). По размерам такие участки были сопоставимы с одной или несколькими печеночными дольками. В сосудах печени отмечалось расширение (практически в 2-3 раза по сравнению с контролем) центральных и междольковых вен и переполнение вен кровью с формированием тромбов (см. рис. 1, в). Также наблюдалось расширение синусоидных капилляров с образованием в их просветах скоплений эритроцитов (см. рис. 1, г). В перикапиллярных пространствах и вокруг центральных вен присутствовало гомогенное светлоокрашенное эозином вещество. В отдельных случаях в паренхиме печени присутствовали небольшие очаги лейкоцитарной инфильтрации. Морфологические изменения почечных телец и канальцев нефронов у животных 1-й группы были значительно менее выраженными, чем изменения, отмеченные в печени. На срезах почек присутствовали деструкция эпителия проксимальных канальцев, расположенных в основном на периферии коркового вещества, и отложения эозинофильного вещества на люминальной поверхности эпителия канальцев. Дистальные канальцы, собирательные почечные трубочки и сосочковые протоки при этом не были изменены. Почечные тельца характеризовались снижением кровенаполнения капилляров. В составе некоторых почечных телец присутствовал пикноз ядер клеток мезангия, висцерального листка капсул и стенок капилляров. В отдельных участках паренхимы почек были резко расширены вены и присутствовали небольшие скопления лейкоцитов вблизи вен. У животных 2-й группы на срезах печени сохранялись дольковая гистоархитектура и радиальное расположение пластинок гепатоцитов с синусоидными капиллярами. Отдельные участки деструкции с замещением пластинок гепатоцитов гомогенным эозинофильным веществом были зарегистрированы только у 2 животных. Реактивные изменения почечных телец и канальцев нефронов у животных 2-й группы, напротив, были более выраженными, чем морфогенетические изменения паренхимы печени, и значительно превосходили нарушения структуры почечных телец и канальцев нефронов у животных 1-й группы. Так, на всей площади коркового вещества регистрировались деформация и уменьшение размеров почечных телец, пикноз ядер клеток мезангия, висцеральных листков капсул и стенок капилляров. На месте многих почечных телец оставались лишь небольшие скопления мелких клеток с пикнотическими ядрами без различимых просветов капилляров (рис. 2, а) и полостей капсул. В почечных тельцах, лежащих в глубоких слоях коры (вероятнее всего в тельцах юкстамедуллярных нефронов), капилляры были расширены и кровенаполнены, как и вены коркового и мозгового вещества почек. Эпителиоциты стенок проксимальных канальцев на всей площади срезов почек имели резко просветленную цитоплазму, апикальный полюс эпителиоцитов был разрушен, в просветах канальцев находилось эозинофильно окрашенное вещество, частично или полностью закрывавшее просветы канальцев (см. рис. 2, б). Помимо деструктивных изменений стенок проксимальных канальцев, в почках у животных 2-й группы отмечалась деструкция дистальных канальцев, петель нефрона, собирательных почечных трубочек и сосочковых протоков. Обсуждение полученных данных. Известно, что разные штаммы PsА обладают разной степенью токсичности по отношению к эукариотам, что связано с особенностями геномов этих штаммов [1]. Выявленные реактивные изменения гистологических элементов паренхимы печени и почек в двух подопытных группах, как мы полагаем, в определенной степени могут быть обусловлены генотипическими особенностями использованных штаммов PsА, а именно - с наличием или отсутствием генов экзотоксинов U и S. Одним из важнейших свойств экзотоксина U, ген которого присутствует у штамма 1840, является выраженное мембранолитическое действие на эукариотические клеткимишени [11, 13]. Присутствие в паренхиме печени животных 1-й группы множественных участков деструкции - от слияния гепатоцитов в пластинки до их замещения эозинофильным веществом - можно предположительно расценивать как последовательные стадии гибели паренхимы вследствие мембранолитического эффекта ExoU, кодируемого геном U. Об этом свидетельствуют и присутствующие в венах печени тромбы, поскольку экзотоксин U способен стимулировать коагуляцию. Отмеченный у животных 1-й группы стаз крови в синусоидных капиллярах, а также присутствие светлого эозинофильного вещества в перисинусоидных пространствах, вероятно, можно рассматривать как следствие внутрипеченочного венозного застоя и тромбоза. Поскольку деструктивные изменения почечных телец у животных 1-й группы не были столь значительны, как реактивные изменения элементов паренхимы печени, можно предполагать наличие у штамма 1840 более выраженного цитотоксического эффекта по отношению к гепатоцитам. В пользу данного предположения свидетельствует то, что гепатотропное цитотоксическое воздействие штамма 1623, у которого ген ExоU отсутствует, практически не проявлялось. Зафиксированные у животных, инфицированных PsА 1623, наиболее выраженные реактивные изменения почечных телец и канальцев нефронов предположительно можно связать с наличием в геноме PsA 1623 гена ExoS и вероятным активным его состоянием. По данным литературы [5], ExoS воздействует на клетки-мишени через связывание с рецепторами врожденного иммунитета TLR 2 и 4. Этот тип рецепторов имеют клетки проксимальных канальцев [4]. Известно, что с TLR-рецепторами проксимальных канальцев нефронов связывается и липополисахарид - эндотоксин грамотрицательных штаммов бактерий, вызывающий деструкцию канальцев [15]. Поскольку липополисахарид является компонентом стенок обоих исследованных штаммов PsА, можно полагать, что разрушение проксимальных канальцев нефронов у животных 1-й группы связано с действием этого эндотоксина, а значительное повреждение канальцев нефронов, отмеченное в почках у животных 2-й группы, явилось, вероятнее всего, результатом сочетанного влияния на канальцы липополисахарида и продукта экспрессии гена ExoS. Поскольку одним из главных проявлений цитотоксического эффекта ExoS на эукариотические клеткимишени является деструкция цитоскелета [8, 9], выявленное у животных 2-й группы повреждение апикального полюса эпителиоцитов проксимальных канальцев свидетельствует о разрушении почечной каемки, что объясняет причину раннего и значительного падения белка в плазме крови у больных с сепсисом. Объективным признаком, указывающим на утрату клетками проксимальных канальцев функции реабсорбции, является присутствие в их просветах эозинофильного вещества - по всей видимости, белка, реабсорбция которого нарушена. Обнаруженные в почках у животных 2-й группы деструктивные изменения дистальных канальцев, петель нефрона и собирательных трубочек также можно связывать с присутствием у штамма 1623 гена ExoS и влиянием соответствующего ему патогена на цитоскелет, с помощью которого в норме осуществляются процессы эндо-и экзопиноцитоза воды и электролитов. Основанием для высказанных выше суждений служит информация о том, что активация генов экзотоксинов PsA наступает при контакте возбудителей с тканями-мишенями [14]. Можно полагать, что отмеченные выше признаки реактивных изменений исследованных гистологических элементов печени и почек у животных под влиянием штаммов 1840 и 1623 PsA являются по своей совокупности проявлением пироптоза - провоспалительного варианта клеточной гибели, инициируемого микробными патогенами [10]. Заключение. Таким образом, результаты проведенного анализа гистологических элементов печени и почек у мышей в модели экспериментального сепсиса, вызванного введением штаммов 1840 и 1623 Pseudomonas aeruginosa, позволяют предполагать существование зависимости между характером реактивных изменений этих элементов и особенностями геномов использованных штаммов возбудителя. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: В. Г. Ж., М. Н. Ч. Сбор и обработка материала: М. Н. Ч., Т. Г. Б. Анализ и интерпретация данных: Т. Г. Б., М. Н. Ч., В. Г. Ж. Написание и редактирование текста: Т. Г. Б., М. Н. Ч., В. Г. Ж. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов

About the authors

T. G. Borovaya

N. F. Gamaleya Federal Research Centre for Epidemiology and Microbiology

Email: tbor27@yandex.ru
Laboratory of Indication & Ultrastructural Analysis of Microorganisms 18 Gamaleya St., Moscow 123098

V. G. Zhukhovitsky

N. F. Gamaleya Federal Research Centre for Epidemiology and Microbiology

Email: zhukhovitsky@rambler.ru
Laboratory of Indication & Ultrastructural Analysis of Microorganisms 18 Gamaleya St., Moscow 123098

M. N. Cherkasova

N. F. Gamaleya Federal Research Centre for Epidemiology and Microbiology

Email: mari.cherkasova.1991@bk.ru
Laboratory of Indication & Ultrastructural Analysis of Microorganisms 18 Gamaleya St., Moscow 123098

References

Supplementary files