ULTRASTRUCTURAL CHARACTERISTICS OF THE ENDOMETRIAL EPITHELIUM DURING THE IMPLANTATION WINDOW IN HEALTHY WOMEN AND IN PATIENTS WITH REPRODUCTIVE FAILURE

Full Text

Введение. Нарушение имплантации человеческого эмбриона в связи с нерецептивным эндометрием является наиболее значимой причиной неудач вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), занимая в их структуре до 70 %, при переносе эмбрионов хорошего качества [2, 5]. В настоящее время интенсивно ведутся поиски эндокринологических, морфологических, иммуногистохимических и молекулярно-биологических маркеров рецептивности [17]. Эпителий эндометрия состоит из секреторных и реснитчатых клеток. В середине лютеиновой фазы менструального цикла (МЦ) на апикальной поверхности секреторных клеток появляются выпячивания - пиноподии, которые считаются маркером рецептивности [15, 18], хотя не удалось подтвердить предиктивную ценность исследования пиноподий у человека [16]. Строение пиноподий меняется по мере прогрессирования секреторной фазы МЦ. С помощью метода сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) установлено, что максимальное развитие пиноподий на поверхности клеток эндометрия приходится на период так называемого «окна имплантации» - периода времени, в течение которого эндометрий становится максимально чувствительным для имплантации бластоцисты [1, 6, 15]. Физиологическое значение развития пиноподий до конца не определено, однако есть ряд доказательств, что именно на поверхности пиноподий происходят начальные этапы адгезии бластоцисты к эндометрию [7, 16]. Так, в экспериментах in vitro бластоцисты преимущественно прикреплялись к зонам эпителия, покрытым пиноподиями [1, 16]. Продолжительность существования пиноподий является предметом спора [1]. По некоторым данным, они существуют менее 48 ч на протяжении средней лютеиновой фазы МЦ, в то время как по другим данным, пиноподии появляются вскоре после овуляции и сохраняются до конца лютеиновой фазы [16]. «Окно имплантации» может сдвигаться по времени, т. е. появляться несколько раньше или позже. Данная ситуация, асинхронность развития пиноподий определяют репродуктивные неудачи, аномалии имплантации, невынашивание беременности, нарушение плацентации и могут вызывать поздние осложнения гестации [3]. Целью настоящего исследования явилось изучение ультраструктуры эндометрия у здоровых женщин и пациенток с репродуктивными неудачами и установленной гипоплазией эндометрия в период «имплантационного окна». Материал и методы. Проведение исследования было одобрено локальным этическим комитетом ФГБУ «Уральского НИИ охраны материнства и младенчества» Минздрава России. В соответствии с положениями Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации последнего пересмотра у всех пациенток и/или их законных представителей до момента включения в процесс было получено информированное согласие на участие в исследовании и использование биологического материала. Было проведено проспективное обсервационное сравнительное контролируемое исследование образцов эндометрия у 119 женщин с маточным фактором бесплодия и невынашиванием беременности. У всех пациенток была установлена гипоплазия эндометрия. Образцы были разделены на группы: в 1-ю - включили образцы эндометрия 46 женщин с маточным фактором бесплодия, во 2-ю - образцы эндометрия 45 женщин с привычным невынашиванием беременности. Группу сравнения составили образцы эндометрия 28 здоровых фертильных женщин, не имеющих в анамнезе случаев невынашивания беременности, имеющих в анамнезе срочные роды через естественные родовые пути без отклонения от физиологического течения беременности и родового акта, закончившиеся рождением здоровых детей. Критерии включения: репродуктивный возраст (18- 45 лет), маточный фактор бесплодия (для пациенток 1-й группы) или привычного невынашивания беременности (для пациенток 2-й группы), ассоциированный с гипоплазией эндометрия, толщина маточного эха (М-эхо), по данным ультразвукового исследования (УЗИ), на 19-22-е сутки МЦ 8 мм и менее (кроме женщин группы сравнения), овуляторный МЦ, информированное добровольное согласие пациентки или ее законного представителя на участие в исследовании. Критерии исключения: возраст менее 18 и более 45 лет, онкологические заболевания, соматическая патология, при которой вынашивание беременности противопоказано, аномалии кариотипа супругов, другие причины бесплодия, не связанные с гипоплазией эндометрия. Исследовали образцы эндометрия, взятые методом pipellebiopsy (вакуумной аспирации тонким катетером) в период предполагаемого «окна имплантации», соответствующего 7-му дню после овуляции, определяемой по данным мочевого теста, чувствительного к пику концентрации в крови лютеинезирующего гормона (ЛГ7+). Исследуемые образцы представляли собой кусочки эпителия эндометрия толщиной около 2-3 мм и размером 2-3×4- 5 мм. Материал отмывали от эритроцитов в изотоническом растворе NaCl и помещали в 2,5 % раствор глутарового альдегида на 0,1М какодилатном буфере (рН 7,2-7,4). Фиксация продолжалась от 60 мин до 7 сут (Holstein, Roosen-Runge, 1981). Материал дофиксировали 1 % осмиевой кислотой на том же буфере, обезвоживали в серии спиртов и высушивали в критической точке возгонки углекислоты (Critical Point Dryer HCP-2, Hitachi). Напыление проводили в ионнораспылительной установке IB-3 (Eiko, Япония) сплавом золота и палладия. Микрофотографии получали при помощи сканирующего электронного микроскопа CamScan S-2 (Cambridge Instruments, Великобритания) при ускоряющем напряжении 20 кВ. В каждом образце просматривали 10-15 полей зрения при ув. 3000. Оценку состояния клеток эпителия проводили при ув. 8000-10 000. Оценку эндометрия проводили по временным и морфологическим параметрам. Статистическую обработку результатов исследований проводили с использованием пакетов прикладных программ Microsoft Excel (2010), StatSoft Statistica 6.0 (StatSoft, США), SPSS Statistics версия 22.0 (IBM Microsoft, США). В случае подчинения распределения признака закону нормального распределения данные представляли в виде средней величины (М) и стандартной ошибки средней (m). Проверку статистических гипотез об отсутствии межгрупповых различий количественных признаков в независимых группах осуществляли с использованием процедуры однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Для показателей, характеризующих качественные признаки, указывали абсолютное значение и относительную величину (%), проверку статистических гипотез осуществляли с использованием критерия хи-квадрат (χ2). Критический уровень значимости различий (p), при котором нулевая гипотеза об отсутствии различий отвергалась и принималась альтернативная, устанавливали равным 0,025 (критерий Краскела-Уоллиса) и при p<0,05 (критерий Вилкоксона). При отклонении распределения признака от закона нормального распределения данные представляли в виде медианы (Ме) и нижнего и верхнего квартилей (25-го и 75-го процентилей, Р25-Р75). Проверку статистических гипотез об отсутствии межгрупповых различий количественных признаков осуществляли с помощью непараметрического критерия Краскела-Уоллиса (Kruskel-Wallis), при отклонении нулевой гипотезы в ходе анализа проводили попарное сравнение групп. Проверку статистических гипотез об отсутствии межгрупповых различий количественных признаков в зависимых группах (до и после лечения) осуществляли с помощью непараметрического критерия Вилкоксона. Результаты исследования. Оценивали частоту встречаемости в образцах эндометрия у пациенток групп наблюдения временных и морфологических параметров. Для оценки временных характеристик формирования «имплантационного окна» определяли состояние присутствующих в момент взятия материала пиноподий. Пиноподии характеризовали как развивающиеся, зрелые, регрессирующие. Развивающиеся пиноподии - куполообразные апикальные выпячивания секреторных клеток, неравномерно покрытые укороченными утолщенными микроворсинками диаметром 0,10-0,15 мкм, в некоторых клетках часть апикальной поверхности была лишена микроворсинок (рис. 1). Зрелые пиноподии - куполообразные апикальные выпячивания секреторных клеток с гладкой апикальной поверхностью (рис. 2). Реснитчатые клетки были «углублены» под поверхность пиноподий. Характерной чертой зрелых пиноподий являлось отсутствие межклеточного соединения и наличие щелей между соседними клетками (рис. 3). Регрессирующие пиноподии - куполообразные апикальные выпячивания секреторных клеток, равномерно покрытые короткими микроворсинками диаметром 0,10 мкм (рис. 4). Выявление регрессирующих пиноподий позволяло сделать заключение об акселерации формирования «имплантационного окна», наличие развивающихся пиноподий - о задержке формирования «имплантационного окна». Наличие в поле зрения пиноподий на разных стадиях развития свидетельствовало об асинхронности формирования пиноподий (рис. 5). Акселерация и асинхронный характер созревания пиноподий чаще наблюдались у пациенток с невынашиванием беременности - в 46,66 % случаев против 17,39 % в группе женщин с бесплодием (р=0,003), превышая значения в группе сравнения 14,30 % более чем в 3 раза (р=0,004) (таблица). Отставание в созревании пиноподий, неравномерность их созревания и развития наблюдались у большинства женщин основных групп: у пациенток с бесплодием - в 82,61 %, у женщин с невынашиванием беременности - в 65,67 %, что значимо превышает уровень значений в группе сравнения - 21,4 %; р1=0,0011, р2=0,0017 (см. таблицу). Зрелые пиноподии определялись в образцах эндометрия у женщин основных групп наблюдения, как правило, только в сочетании с созревающими пиноподиями, имели неравномерный характер распределения на поверхности эндометрия и чаще всего располагались в устьях желез. Зрелые пиноподии встречались у 34,7 % женщин с бесплодием и у 55,56 % женщин с невынашиванием беременности, что достоверно ниже, чем у женщин в группе сравнения - 71,42 %; р1=0,002. Морфологические характеристики включали в себя следующее: «спокойный» эпителий, гипоплазия пиноподий, гетероморфный эпителий. «Спокойный» эпителий - эпителиальные секреторные клетки с плоской апикальной поверхностью, покрытые микроворсинками диаметром 0,10 мкм и длиной около 0,50 мкм. Хорошо выраженные межклеточные контакты на микрофотографиях имели вид выпуклых валиков, позволяя видеть многоугольную форму эпителиальных клеток. В эпителии выявлялись равномерно расположенные реснитчатые клетки (рис. 6). В образцах эндометрия у пациенток с бесплодием значимо более часто визуализировались поля «спокойного» эпителия с ровной апикальной поверхностью, отсутствием секреторной активности. «Спокойный» эпителий выявлен у 67,39 % пациенток с бесплодием, в группе сравнения - у 14,28 % женщин (р=0,001), у пациенток с невынашиванием беременности - в 42,20 % случаев, что также достоверно превышает значения в группе сравнения (р=0,012) (см. таблицу). Гипоплазия пиноподий - присутствие в образце единичных «островков», содержащих 5-15 пиноподий (рис. 7). Островки пиноподий с характерным отсутствием межклеточных контактов обнаруживались на фоне «спокойного» эпителия с хорошо выраженными межклеточными контактами. Гипоплазия пиноподий в период «имплантационного окна» наблюдалась у 52,17 % женщин с бесплодием и у 37,78 % женщин с невынашиванием беременности, что выше уровня значений в группе сравнения (р1=0,001, р2=0,013) (см. таблицу). Гетероморфность секреторных клеток определялась нечасто и характеризовалась различной формой, размерами и строением секреторных клеток эндометрия (рис. 8). Форма клеток могла быть овальной и полигональной, размеры отличались в 2 раза и более. Пиноподии имели, как правило, различную хронологическую картину созревания. Такое строение железистого эпителия часто сопровождалось наличием атипичных клеток микроокружения - реснитчатых клеток. Возможно, именно от их строения и функции зависели правильный «каркас» клеточной мембраны и межклеточные взаимодействия, формирующие конфигурацию секреторных клеток эндометрия. Гетероморфность секреторных клеток определяли у 15,22±5,45 % женщин с бесплодием иу 2,22±0,20 % пациенток с невынашиванием беременности. В группе сравнения подобные структурные нарушения не выявлены. Реснитчатые клетки при созревании пиноподий «углублены» под их поверхность, так что при исследовании с помощью СЭМ на поверхности образца выявляются кончики ресничек. Мы определяли наличие атипичных реснитчатых клеток. Их поверхность становилась куполообразной с небольшим числом редко расположенных на апикальной поверхности ресничек (см. рис. 8). Другой атипией реснитчатых клеток являлась высокая плотность их распределения - гиперплазия реснитчатых клеток либо, напротив, низкая плотность распространения, гипоплазия, другие нарушения. Данная патология часто сочеталась с гетероморфными секреторными клетками либо асинхронностью созревания пиноподий (рис. 9). Наличие атипичных реснитчатых клеток отмечалось у 50,0 % женщин с бесплодием, что значимо выше, чем в образцах эндометрия в контрольной группе - 7,14 % (р=0,0016), и превышало аналогичный показатель у женщин с невынашиванием беременности - 28,88 %, не достигая уровня значимости (см. таблицу). Характерной чертой при формировании пиноподий являются разрушение межклеточных контактов и наличие «щелей» между клетками эпителия, необходимое для имплантации эмбриона (см. рис. 3). Сохранение межклеточных контактов может быть одним из факторов, приводящих к отсутствию имплантации (рис. 10). В основных группах наблюдения визуализировалось наличие межклеточных контактов между секреторными клетками эндометрия - в 69,56 % в группе женщин с бесплодием ив 84,44 % случаев в группе женщин с невынашиванием беременности, что чаще, чем в группе контроля, на 7,14 % (р1, 2<0,001) (см. таблицу). Обсуждение полученных данных. Покровный эпителий эндометрия первым «встречает» бластоцисту в период имплантации. Ультраструктурные изменения его поверхности, исследуемые с помощью сканирующей электронной микроскопии, открыли новый уровень рецептивности эндометрия - тканевый. Падение экспрессии рецепторов к эстрадиолу и прогестерону в имплантационном эндометрии совпадает с изменением ультраструктуры апикальной поверхности мембран эпителия с образованием пиноподий [8]. Именно на поверхности пиноподий и происходит адгезия бластоцисты, потенцируемая взаимодействием лейкемия-ингибирующего фактора (LIF) и его рецептора (LIFR), экспрессией молекул адгезии (αvβ3), остеопонтина и эпидермального фактора роста (HB-EGF) [16]. В нашем исследовании ультраструктурная морфологическая картина эндометрия у пациенток основных групп наблюдения характеризовалась высокой частотой гипоплазии и аплазии пиноподий в период «окна имплантации», наличием плотных межклеточных контактов в секреторных клетках эндометрия, частым асинхронным развитием и неравномерным созреванием полей пиноподий. У пациенток с бесплодием в ультраструктурной картине эндометрия доминировали поля отсутствия пиноподий, их гипоплазия, гетероморфность секреторных клеток в сочетании с атипией клеток микроокружения. Зрелые пиноподии редки и распределены в полях эндометрия неравномерно, располагаясь в основном в устьях желез. Клетки микроокружения (реснитчатые клетки) экспрессируют на своей поверхности трансмембранный эпителиальный муцин - MUC1, который отсутствует на поверхности пиноподий. Его биологическая роль заключается в отталкивании бластоцисты и ее правильной ориентации для инвазии только в области пиноподий [10]. У пациенток с невынашиванием беременности проблема связана с хронометрическим отставанием в созревании пиноподий, асинхронном их развитии, а также с отсутствием разобщения межклеточных контактов в период «имплантационного окна». Доказано, что одним из этапов в созревании пиноподий является нарушение межклеточных контактов поверхностного эпителия, «разобщение» клеток [16]. Биологический смысл этого явления, на наш взгляд, заключается в «облегчении» инвазии бластоцисты в эндометрий. Зрелые пиноподии визуализировались в половине исследованных образцов эндометрия у женщин с невынашиванием беременности, однако их поля также располагались неравномерно. Заключение. Таким образом, выявленные нарушения определяют механизмы нарушения адгезии бластоцисты и инвазии трофобласта на разных стадиях имплантации у пациенток с маточным фактором бесплодия и невынашивания беременности. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: О. А. М., Г. Н. Ч. Сбор и обработка материала: Е. Е. Б., И. Д. Щ., А. А. Г. Статистическая обработка данных: О. А. М., И. Д. Щ., А. А. Г. Анализ и интерпретация данных: Б. Е. Е., О. А. М., Г. Н. Ч. Написание текста: О. А. М. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

About the authors

O. A. Melkozerova

Federal Research Institution of Maternity and Child Care

Email: abolmed1@mail.ru
1 Repina St., Yekaterinburg 620014

G. N. Chistyakova

Federal Research Institution of Maternity and Child Care

1 Repina St., Yekaterinburg 620014

Ye. Ye. Bragina

M. V. Lomonosov Moscow State University; A. N. Belozersky Research Institute of Physico-Chemical Biology

GSP-1 build. 40 Leninskie Gory, Moscow 119992

A. A. Grishkina

Federal Research Institution of Maternity and Child Care

1 Repina St., Yekaterinburg 620014

I. D. Shchedrina

Federal Research Institution of Maternity and Child Care

1 Repina St., Yekaterinburg 620014

References

Supplementary files