Autophagy as a life support marker of isolated hepatocytes

Full Text

В последнее время клеточные культуры гепатоцитов рассматривают как возможный источник для трансплантации при лечении наследственных или терминальных заболеваний печени [1]. Имеются данные, демонстрирующие терапевтический потенциал трансплантированных зрелых гепатоцитов в лечении наследственного метаболического заболевания печени [2] и острой печёночной недостаточности [3]. В связи с тем что печень является центральным органом метаболизма и детоксикации, изолированные гепатоциты используются в качестве модели для выявления фармакологических и токсикологических реакций лекарственных препаратов [4]. Модели первичной культуры гепатоцитов применяют для изучения метаболизма, секреции и регенерации печени [5].

В то же время сохраняются проблемы определения оптимальной методологии и эффективности культивирования первичных гепатоцитов [6]. Особое внимание уделяется фенотипическим характеристикам изолированных гепатоцитов, которые должны соответствовать состоянию клеток in vivo [7].

Известно, что механизмом сохранения гомеостаза клеток в условиях изменения внутриклеточной или внеклеточной микросреды является аутофагия. Аутофагия присутствует во всех эукариотических клетках на базальном уровне, и может быть селективной, нацеленной на определённый субклеточный компартмент, или неселективной [8]. Аутофагический механизм чрезвычайно чувствителен к метаболическим изменениям внеклеточной микросреды, и адаптивный аутофагический ответ важен для преодоления стрессовых условий [9].

Целью работы было выявление структурных признаков аутофагии в цитоплазме изолированных гепатоцитов в динамике их культивирования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Гепатоциты крыс-самцов линии Вистар массой 180–200 г выделяли методом рециркуляторной ферментативной перфузии с использованием 0,03% раствора коллагеназы («ICN Biomedicals, Inc», США) и отделяли от непаренхимных клеток с помощью дифференциального центрифугирования. Жизнеспособность клеток оценивали методом исключения трипанового синего («Serva», Германия). В эксперимент брали клетки с жизнеспособностью не менее 90%. Полученные клетки были посажены на 6-луночные планшеты (Corning), покрытые коллагеном в концентрации 10х10⁴ клеток/лунок. Гепатоциты культивировались в питательной среде RPMI-1640 (Gibco, США), рН 7.4, содержащей 10% эмбриональной сыворотки коров (Gibco, США), 100 ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл гентамицина при стандартных условиях (5% СО₂, при температуре 37 ºС и влажности 95%). На проведение исследования получено разрешение Комитета по Биомедицинской этике Федерального исследовательского центра фундаментальной и трансляционной медицины (протокол № 7 от 10.03.2020 г.).

Для анализа клеточного цикла культивированных гепатоцитов был использован метод проточной цито- флуориметрии, с применением ДНК интеркалирующего флуоресцентного красителя Пропидий йодида (PI). Клетки культивировали в течение 1, 24 и 48 ч. Для снятия клеток с пластика использовали TrypLE реагент (Gibco, США), клетки осаждали центрифугированием, отмывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и фиксировали ледяным 70% этанолом. После инкубации с буфером для экстракции ДНК клетки повторно центрифугировали и промывали PBS. Окрашенные пропидий йодидом клетки анализировали на проточном цитофлуориметре CytoFlexS (Beckman Coulter, США).

Для изучения ультраструктурной организации гепатоцитов взвесь клеток фиксировали в 4% растворе параформальдегида, приготовленном на среде Хенкса, дофиксировали в течение 1 ч в 1% растворе ОsO₄ на фосфатном буфере (pH=7,4), дегидратировали в этиловом спирте возрастающей концентрации и заключали в эпон (Serva, Германия). Полутонкие срезы толщиной 1 мкм получали на ультрамикротоме Leica EM UC7 (Leica Microsystems, Германия), окрашивали толуидиновым синим и изучали под световым микроскопом “LEICA DME” (Leica Microsystems, Германия). Ультратонкие срезы толщиной 70–100 нм контрастировали насыщенным водным раствором уранилацетата и цитратом свинца и изучали под электронным микроскопом JEM 1400 (JEOL, Япония).

Морфометрический анализ проводили с помощью компьютерной программы Image J (Wayne Rasband, США). Определяли диаметры ядер и цитоплазмы гепатоцитов, объёмы ядер и цитоплазмы, ядерно-цитоплазматическое соотношение. Концентрацию внутриклеточных органелл оценивали при увеличении х30000 при использовании закрытой тестовой системы из 500 точек. Среднее значение (М) и стандартное отклонение (SD) вычисляли с помощью программного обеспечения Microsoft Excel (Microsoft, США). Достоверность различий между исследуемыми параметрами определяли с помощью программного обеспечения Statistica 6.0 (StatSoft, США) с использованием U-критерия Манна-Уитни при уровне достоверности 95% (р <0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ

При культивировании изолированных гепатоцитов в течение 48 ч отмечали последовательное снижение абсолютного объёма клеток. Через 24 ч объём клеток снизился на 57%, а через 48 ч – на 76%, по сравнению с объёмом гепатоцитов через 1 ч после культивирования. При этом абсолютные объёмы ядер гепатоцитов достоверно не изменялись. Ядерно-цитоплазматическое соотношение через 24 ч увеличилось в 2 раза, через 48 ч – в 6 раз (рис. 1a–c, табл.). Следовательно, снижение объёмов гепатоцитов в процессе культивирования происходило за счёт снижения объёмной доли цитоплазмы клеток.

 

Рис. 1. Морфология и клеточный цикл изолированных гепатоцитов в динамике культивирования: a, b, c – гепатоциты в динамике культивирования через 1, 24 и 48 ч соответственно. Окраска толуидиновым синим. Увеличение ×400. d – распределения гепатоцитов по фазам клеточного цикла при их культивировании в стандартной питательной среде. G0/G1, S, G2/M – стадии клеточного цикла

 

Таблица. Результаты морфометрии гепатоцитов в динамике культивирования (M±SD)

Table. Results of hepatocyte morphometry in the course of cultivation (M±SD)

Параметр	1 ч	24 ч	48 ч
Гепатоциты, V (мкм3)	17089,77±10465,86	7322,782±3682,01*	4154,77±1904,82*
Ядра гепатоцитов, V (мкм3)	423,04±379,21	427,73±278,91	514,83±242,8
ЯЦИ	0,03±0,02	0,07±0,05*	0,18±0,03*
Митохондрии, Vv (%)	14,2±2,72	14,7±1,78	10,4±2,38*
ЭПР, Vv (%)	1,41±0,43	3,92±1,04	2,02±0,56
Аутофагосомы, Vv (%)	5,87±1,45	21,2±5,13*	8,78±3,56*#
Аутолизосомы, Vv (%)	0,94±1,22	2,65±2,51*	6,88±2,21*#
Гликоген, Vv (%)	5,41±1,14	1,42±1,08*	0,86±0,84*

Примечание: Vv – объёмная плотность структур; ЭПР – эндоплазматический ретикулум; ЯЦИ – ядерно-цитоплазматический индекс (Vv ядра/Vv цитоплазмы). 1, 24, 48 ч – время культивирования гепатоцитов; * – отличие от соответствующих величин через 1 ч культивирования, # – отличие от соответствующих величин через 24 ч культивирования (p ≤0,05).

 

Оценка клеточного цикла продемонстрировала накопление гепатоцитов в G₀/G₁ через 24 ч культивирования. В течение исследованных 48 ч гепатоциты сохраняли свою жизнеспособность без повышения процента клеток в стадии апоптоза (рис. 1d).

Исследование ультраструктурной организации гепатоцитов через 24 ч культивирования выявило наличие в цитоплазме клеток аутофагосом с фрагментами цитоплазмы и розеток гликогена (рис. 2a) и аутолизосом с частично деградированным материалом (рис. 2b).

Если через 24 ч культивирования в составе аутофагосом наблюдали преимущественно гранулы гликогена, то при изучении ультраструктуры гепатоцитов через 48 ч культивирования были выявлены аутофагосомы с фрагментами цитоплазмы и митохондриями (рис. 2c, d). Митохондрии часто были окружены цистернами гранулярного эндоплазматического ретикулума (рис. 2e). Кроме того, наблюдали митохондрии с нарушением строения крист и повышенное количество аутолизосом с включениями мембранных структур, находящихся на разной стадии деградации (рис. 2f).

 

Рис. 2. Ультраструктурная организация гепатоцитов в процессе культивирования. a – аутофагосома с розетками гликогена через 24 ч культивирования (стрелка); b – аутолизосома с частично деградированным материалом через 24 ч культивирования (стрелка); c – аутофагосома с фрагментом цитоплазмы через 48 ч культивирования (стрелка); d – аутофагосома с митохондрией через 48 ч культивирования (стрелка); e – отсутствие гликогена в цитоплазме и образование колец эндоплазматического ретикулума вокруг митохондрий через 48 ч культивирования (стрелка); f – повышенное количество аутолизосом с включениями мембранных структур, находящихся на разной стадии деградации через 48 ч культивирования (стрелки). Увеличение ×30000

 

Морфометрическое исследование ультраструктурной организации гепатоцитов выявило, что к 48 ч культивирования в гепатоцитах достоверно снижались объёмные плотности гликогена и митохондрий на 84 и 27% (p <0,05) соответственно (см. табл.). При этом возрастали на 50% и в 7 раз соответственно (p <0,05) объёмные плотности аутофагосом и аутолизосом (см. табл.).

ОБСУЖДЕНИЕ

Аутофагия является катаболической программой, нацеленной на элиминацию и деградацию макромолекулярных белковых агрегатов, субклеточных органелл и запасных питательных веществ (гликогена и липидов), для поддержания клеточного гомеостаза и активируется в условиях стресса. Метаболиты, образующиеся в лизосомах в результате аутофагии, повторно используются в качестве источников энергии или строительных блоков для синтеза макромолекул [10].

Известно, что гепатоциты играют жизненно важную, ключевую роль в хранении и образовании энергетического ресурса – гликогена [5]. Данные литературы свидетельствуют о взаимодействии между аутофагией и углеводным обменом и наличием динамической обратной связи между аутофагией и клеточным энергетическим балансом [10]. Гликоген может распознаваться и поглощаться аутофагосомами, а затем переноситься в лизосомы для разложения. Этот процесс называется «гликофагия» [11]. В нашем исследовании через 24 ч культивирования гепатоцитов наблюдали преимущественно аутофагосомы с гликогеном, а через 48 ч появлялись аутофагосомы с митохондриями. На этот период отмечали наименьшее число клеток в S-фазе клеточного цикла и наличие высокого процента клеток в стадии G₀/G₁. Известно, что в условиях дефицита аминокислот прекращаются синтез белка и митоз, и аутофагический сигнальный путь активируется для высвобождения аминокислот путём расщепления белков с целью поддержания доступности аминокислотного пула для синтеза жизненно важных белков [11].

Одной из проблем, ограничивающей использование в медицине клеточных культур гепатоцитов, является потеря митотической активности клеток при их культивировании [12]. Остановка клеточного цикла была показана и в нашем исследовании. При этом на протяжении 48 ч культивирования возрастал уровень базальной аутофагии гепатоцитов и не увеличивалось число клеток в состоянии апоптоза. Аутофагия в данном случае, по-видимому, поддерживала уровень дифференцированности гепатоцитов и являлась эффективным способом сохранения клеточного гомеостаза [7].

Полученные нами данные свидетельствуют, что при культивировании изолированных гепатоцитов в стандартной питательной среде происходит возрастание базальной аутофагии в цитоплазме клеток. Через 24 ч эксперимента развивалась гликофагия, т. к. аутофагосомы содержали преимущественно материал, являющийся источником энергии для клетки – гранулы гликогена. В дополнение к гликофагии через 48 ч наблюдалась митофагия, в связи с потребностью клетки в аминокислотах и деградацией белковых комплексов. Полученные данные свидетельствуют о вкладе аутофагии в процесс выживания первичной культуры гепатоцитов и могут быть использованы как показатель адекватности условий культивирования.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, методами проточной цитофлуориметрии, световой и электронной микроскопии охарактеризована первичная культура гепатоцитов в динамике культивирования в стандартной питательной среде. Выявлены остановка клеточного цикла в G₀/G₁ стадии через 24 ч культивирования гепатоцитов и сохранение их жизнеспособности без повышения процента клеток в стадии апоптоза. Возрастание базальной аутофагии в цитоплазме клеток – преобладание гликофагии и митофагии, по-видимому, является механизмом поддержания клеточного гомеостаза в процессе культивирования гепатоцитов.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ /ADDITIONAL INFO

Источник финансирования. Работа выполнена за счет бюджетного финансирования в рамках государственного задания № NFWNR-2022-00120045.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования: Н.П. Бгатова, А.О. Соловьева, Ю.С. Таскаева. Сбор и обработка материала: Р.С. Досымбекова, С.М. Мирошниченко, Р.А. Князев, А.О. Соловьева. Анализ и интерпретация данных: Н.П. Бгатова, К.О. Шарипов, З.Б. Тунгушбаева. Написание текста: Н.П. Бгатова, Ю.С. Таскаева.

Funding. The work was financed from budget under the state assignment No. NFWNR-2022-00120045.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Author contributions. N.P. Bgatova, A.O. Solovieva, and Yu.S. Taskaeva created the research concept and design; R.S. Dosymbekova, S.M. Miroshnichenko, R.A. Knyazev, and A.O. Solovieva collected and processed the material; N.P. Bgatova, K.O. Sharipov, Z.B. Tungushbaeva analyzed and interpreted the data; N.P. Bgatova and Yu.S. Taskaeva wrote the text.

About the authors

Nataliya P. Bgatova

Research Institute of Clinical and Experimental Lymphology – Branch of the Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: nataliya.bgatova@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-4507-093X
SPIN-code: 3126-6079

MD, Dr. Sci. (Biol.), Prof.

Russian Federation, Novosibirsk

Raushan S. Dossymbekova

Kazakh National Medical University named after S.D. Asfendiyarov

Email: dos.raushan@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5241-1926
SPIN-code: 3723-1316

MD, Dr. Sci. (Biol.)

Kazakhstan, Almaty

Julia S. Taskaeva

Research Institute of Clinical and Experimental Lymphology – Branch of the Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences

Email: inabrite@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2812-2574
SPIN-code: 7154-4540

MD, Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation, Novosibirsk

Svetlana M. Miroshnichenko

Research Institute of Biochemistry Federal Research Center of Fundamental and Translational Medicine

Email: svmiro@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-6740-8241
SPIN-code: 6147-2989
Russian Federation, Novosibirsk

Roman A. Knyazev

Research Institute of Biochemistry Federal Research Center of Fundamental and Translational Medicine

Email: knjazev_roman@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2678-8783
SPIN-code: 7401-5637

MD, Cand. Sci. (Biol.)

Russian Federation, Novosibirsk

Anastasia O. Solovieva

Research Institute of Clinical and Experimental Lymphology – Branch of the Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences

Email: solovevaao@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-7740-8456
SPIN-code: 5351-2406

MD, Cand. Sci. (Biol.)

Russian Federation, Novosibirsk

Kamalidin O. Sharipov

Kazakh National Medical University named after S.D. Asfendiyarov

Email: skamalidin@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5946-5521
SPIN-code: 1085-4647

MD, Dr. Sci. (Biol.), Prof.

Kazakhstan, Almaty

Zina B. Tungushbaeva

Kazakh National Pedagogical University named after Abai

Email: alua2002@yandex.kz
ORCID iD: 0000-0003-4432-0658
SPIN-code: 6045-6416

MD, Dr. Sci. (Biol.), Prof.

Kazakhstan, Almaty

References

Supplementary files