RAPID METHOD OF THE AMYLOID STAINING WITH CONGO RED FOR LIGHT AND FLUORESCENCE MICROSCOPY

Full Text

Отложения амилоида в тканях нередко являются признаком возрастных изменений, а в ряде случаев свидетельствуют и о наличии патологического процесса. При этом происходит формирование особых внеклеточных агрегатов фибриллярных форм некоторых белков [3, 6]. Для выявления скоплений амилоида предложены несколько гистохимических методов, среди которых наиболее часто используемым является окраска конго красным [1, 2]. Данный способ выявления амилоида, основанный на регистрации зеленого свечения амилоидных скоплений, окрашенных конго красным, в поляризованном свете, обладает высокой специфичностью, однако имеет ряд существенных недостатков. Среди них можно отметить непостоянство зеленого оттенка амилоидных скоплений и большую общую продолжительность процедуры окрашивания, которая составляет не менее 2 ч, не считая времени на предварительную подготовку рабочих растворов. Кроме того, общепринятая методика окраски амилоида по Беннхольду [4] предполагает дифференцировку срезов в 80% этаноле после окрашивания конго красным. Продолжительность дифференцировки варьирует и, как следствие, процедура требует непрерывного наблюдения под микроскопом и потому не может быть автоматизирована. Подобрать единый по времени режим дифференцировки, необходимый для сохранения специфичности окраски, не представляется возможным, что, в свою очередь, часто приводит к сохранению на срезах неспецифического окрашивания. Наконец, рекомендованное для данной методики заключение препаратов в полистирол, предполагающее их обезвоживание в этаноле восходящей концентрации и просветление в ксилоле, усиливает выраженность остаточной неспецифической окраски, значительно ухудшая качество препаратов. В связи с этим целью данной работы стало совершенствование метода окраски амилоида конго красным для сокращения общей продолжительности процедуры и увеличения устойчивости специфического окрашивания амилоида. Исследование проведено на образцах миокарда левого желудочка сердца у 5 людей (мужчин и женщин) с посмертно диагностированным амилоидозом миокарда из архива лаборатории кардиомиопатий Института сердечно-сосудистых заболеваний Первого Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И. П. Павлова. Образцы были фиксированы в 10% растворе формалина и после стандартной гистологической проводки залиты в парафин по общепринятой методике. С парафиновых блоков делали срезы толщиной 5 мкм. Для выявления амилоида использовали 1% водный раствор конго красного (Sigma-Aldrich, США). Ядра клеток окрашивали гематоксилином Джилла (БиоВитрум, Россия). В ходе отработки методики окрашивания нами были испробованы разные подходы. Все они предполагали окрашивание срезов раствором конго красного без последующей обработки в растворе карбоната лития и дифференцировки в 80% этаноле (как в случае окраски по Беннхольду). Часть срезов сразу после депарафинирования обрабатывали раствором красителя, в то время как другие - подвергали предварительному нагреванию в различных жидкостях - дистиллированной воде, 2% растворе уксусной кислоты или специальном буфере S1700 (Dako, Дания), используемом в иммуногистохимических исследованиях для теплового демаскирования антигена. В качестве среды для заключения также были испробованы разные варианты, среди которых перманентная среда Cytoseal (Thermo Scientific, США), флюоресцентная среда Fluorescence Mounting Medium и среда Ultramount Aqueous Permanent Mounting Medium (Dako, Дания). Использование среды Cytoseal предполагает предварительное обезвоживание срезов в этаноле и просветление их в ксилоле, в то время как заключение в Fluorescence Mounting Medium или Ultramount Mounting Medium производится после промывки срезов в дистиллированной воде (без проведения препаратов через этанол и ксилол). Ultramount Mounting Medium (в отличие от двух других вариантов сред), согласно инструкции производителя, применяется без последующего заключения под покровное стекло. Сравнение полученных результатов окрашивания и заключения срезов, включающее как оценку окрашивания с использованием метода световой микроскопии, так и оценку интенсивности флюоресценции, позволило представить оптимальный протокол окраски амилоида. Удалить парафин и регидратировать срезы обычным способом. Промыть срезы в дистиллированной воде (2 мин). Удалить избыток жидкости фильтровальной бумагой и нанести на срезы необходимое количество 2% раствора уксусной кислоты. Чтобы жидкость не растекалась по предметному стеклу, рекомендуется нарисовать специальным фломастером (Dako Pen) гидрофобный круг вокруг срезов. Нагреть стекло со срезами и раствором уксусной кислоты над пламенем спиртовки до появления мелких пузырьков (приблизительно 95-99 ºC), после чего незамедлительно переместить предметное стекло в подогретую до 50-60 ºC дистиллированную воду и промывать в течение 3 мин при постоянном покачивании. Удалить избыток жидкости со срезов, нанести необходимое количество раствора гематоксилина Джилла (БиоВитрум, Россия) и инкубировать 1 мин при комнатной температуре. Удалить раствор красителя со срезов и сполоснуть стекла в щелочной воде (2 капли 10% аммиака на 100 мл дистиллированной воды) в течение 1 мин. Покачивая, промыть стекла в дистиллированной воде 3 мин. Удалить избыток жидкости и нанести на срезы необходимое количество 1% водного раствора конго красного (Sigma-Aldrich, США). Инкубировать срезы в растворе красителя в течение 2 мин при комнатной температуре. Удалить краситель и промыть срезы в двух порциях дистиллированной воды (по 1 мин). Максимально удалить жидкость со срезов и предметного стекла фильтровальной бумагой и нанести на срезы необходимое количество среды для заключения Ultramount Aqueous Permanent Mounting Medium, после чего либо оставить до высыхания среды, либо заключить срезы под покровное стекло. Общая продолжительность окраски по данному протоколу составляет около 50 мин, что в 2 раза меньше того времени, которое требуется на окраску классическим методом Беннхольда, приводимым в большинстве руководств по гистологической технике. Несмотря на значительное сокращение длительности обработки (в том числе и в растворе красителя), при использовании усовершенствованного протокола удается получить очень хорошее качество окраски амилоида (рисунок). Вероятно, процедура предварительного нагревания в уксусной кислоте способствует более прочному связыванию красителя (конго красного) с амилоидом, вследствие чего последний приобретает насыщенно оранжево-розовый цвет. При анализе полученных препаратов под световым микроскопом скопления амилоида контрастно выявляются на фоне мышечной ткани сердца, окрашенной в голубовато-серый цвет. Это делает амилоид легко детектируемым даже при малом (×10) увеличении микроскопа. Процедура нагревания никак не сказывается на качестве окрашивания срезов гематоксилином (ядра клеток приобретают синий цвет при использовании стандартной процедуры докраски). При использовании метода флюоресцентной микроскопии (см. рисунок) представленный протокол позволяет получить высокую интенсивность флюоресценции амилоида (в красном диапазоне спектра - 600-650 нм) при практически полном отсутствии флюоресценции мышечной ткани. Более контрастной флюоресцентной визуализации амилоида можно добиться, возбуждая автофлюоресценцию мышечной ткани коротковолновым светом (см. рисунок). Было отмечено, что полученное в данном случае оптимальное соотношение сигнал/фон наилучшим образом сохраняется при использовании в качестве среды для заключения Ultramount Permanent Mounting Medium (Dako, Дания). Качество полученных препаратов было выше при сравнении с результатами использования более сложного «щелочного» метода окраски конго красным [5]. Сохранность препаратов, пригодных для анализа с использованием флюоресцентного или конфокального микроскопов, составляет не менее 4 мес. Результаты, полученные при использовании протокола, включающего этап нагревания срезов в специальном буфере S1700 (с заключением препаратов в среду Ultramount), были сопоставимы с результатами, полученными при использовании уксусной кислоты (с заключением препаратов в ту же среду). Различие состояло в более интенсивном (в случае использования S1700) окрашивании мышечной ткани, выявленном при анализе препаратов под световым микроскопом. Использование S1700 приводит к тому, что мышечная ткань приобретает более темный серо-коричневый цвет. Интенсивность окрашивания амилоида при этом не уменьшается, а контрастность даже несколько возрастает (за счет более темного фона). Отношение сигнал/фон, выявляемое с помощью флюоресцентного микроскопа, в случае использования S1700 сопоставимо с полученным при использовании процедуры нагревания срезов в растворе уксусной кислоты. Тем не менее, несмотря на сходство результатов, мы считаем, что использование раствора уксусной кислоты имеет ряд преимуществ перед применением S1700. В частности, при анализе препаратов под световым микроскопом более темное окрашивание ткани в целом, полученное при использовании S1700, несколько усложняет общее восприятие препарата. Кроме того, раствор уксусной кислоты, в отличие от коммерческого буфера S1700, является общедоступным лабораторным реактивом. При применении дистиллированной воды в качестве жидкости для предварительного нагревания срезов яркость окраски амилоида и интенсивность его флюоресценции были понижены по сравнению с получаемыми при использовании 2% раствора уксусной кислоты. В целом процедура предварительного нагревания срезов в водной среде, особенно с кислым рН, оказывает положительное влияние на качество окрашивания амилоида и интенсивность его флюоресценции. Данное обстоятельство особенно существенно в силу того, что традиционно методом улучшения окрашивания конго красным считается обработка срезов в щелочном растворе [4]. Также можно отметить, что предварительное нагревание придает прочность окраске амилоида и делает ее устойчивой к длительному (до 20 мин) промыванию в воде. Анализ результатов использования различных сред для заключения показал, что во всех описанных выше случаях наиболее пригодной оказывается среда Ultramount Permanent Mounting Medium. Её применение способствует поддержанию яркости и контрастности окрашивания амилоида конго красным, а также сохранению соотношения специфической и фоновой флюоресценции (сама среда при этом характеризуется отсутствием автофлюоресценции). Согласно инструкции производителя, Ultramount Permanent Mounting Medium не требует заключения под покровное стекло, однако, как показывают результаты наших исследований, покровное стекло может быть использовано - это никак не влияет на качество окраски, но позволяет сократить время от момента нанесения среды на срезы до просмотра препаратов. При использовании для заключения флюоресцентной среды Fluorescence Mounting Medium была отмечена постепенная диффузия окраски со срезов уже после заключения под покровное стекло. Это приводило к ухудшению получаемого в итоге качества окрашивания препаратов, а также существенно усиливало фоновую флюоресценцию. Применение перманентной среды Cytoseal (с предварительным проведением препаратов через этанол восходящей концентрации и ксилол) приводило к изменению оттенка окраски мышечной ткани на более розовый, что существенно снижало контрастность амилоида и затрудняло его детекцию при малом увеличении микроскопа. В случае использования Cytoseal также было отмечено снижение интенсивности флюоресценции амилоида (по сравнению с использованием Ultramount). Таким образом, разработан усовершенствованный протокол окраски амилоида конго красным, позволяющий селективно выявлять амилоид при световой и флюоресцентной микроскопии. Препараты, полученные согласно представленному протоколу, характеризуются высокой контрастностью окраски амилоида при исследовании на световом уровне, а также высокой интенсивностью его флюоресценции. Преимуществом разработанного протокола перед описанными ранее является значительное сокращение общей продолжительности окраски, увеличение устойчивости специфического окрашивания амилоида и исключение из протокола этапа дифференцировки. Последнее позволяет стандартизировать протокол по времени (постоянный контроль окрашивания под микроскопом в этом случае не требуется) и избежать сохранения неспецифического окрашивания.

About the authors

V. V. Gusel’nikova

RAS Research Institute of Experimental Medicine

Laboratory of Functional Morphology of the Central and Peripheral Nervous System, Department of General and Special Morphology

O. V. Kirik

RAS Research Institute of Experimental Medicine

Email: olga_kirik@mail.ru
Laboratory of Functional Morphology of the Central and Peripheral Nervous System, Department of General and Special Morphology

Ye. A. Fyodorova

RAS Research Institute of Experimental Medicine

Laboratory of Functional Morphology of the Central and Peripheral Nervous System, Department of General and Special Morphology

M. M. Shavlovskiy

RAS Research Institute of Experimental Medicine; I. P.Pavlov First St. Petersburg State Medical University

Laboratory of Functional Morphology of the Central and Peripheral Nervous System, Department of General and Special Morphology; Laboratory of Cardiomyopathies, Institute of Cardiovascular Diseases

A. Ya. Gudkova

I. P.Pavlov First St. Petersburg State Medical University

Laboratory of Cardiomyopathies, Institute of Cardiovascular Diseases

D. E. Korzhevskiy

RAS Research Institute of Experimental Medicine; I. P.Pavlov First St. Petersburg State Medical University

Email: dek2@yandex.ru
Laboratory of Functional Morphology of the Central and Peripheral Nervous System, Department of General and Special Morphology; Laboratory of Cardiomyopathies, Institute of Cardiovascular Diseases

References

Supplementary files