FORMATION OF THE GABAERGIC NEURAL NETWORK IN VENTROLATERAL PARTS OF THE OF SOLITARY TRACT NUCLEUS IN NORM AND AFTER PRENATAL SEROTONIN DEFICIENCY

Full Text

В каудальной части ядра одиночного тракта (ЯОТ) расположены вентральное и латеральное субъядра, входящие в состав бульбарного дыхательного центра. Значительный объем информации, поступающей в эти субъядра, определяет основную их функцию, заключающуюся в восприятии и обработке поступающих в данную область афферентных сигналов [4]. Основная часть нейронов, составляющих вентральное и латеральное субъядра ЯОТ, являются нейронами типа Rα, контролирующими процесс вдоха, со снижающейся и Rβ - повышающейся биоэлектрической активностью при растяжении легких. Установлено наличие моносинаптических связей между нейронами ЯОТ и диафрагмальными мотонейронами, непосредственно участвующими в формировании глубины, частоты и ритма дыхания [6]. Функции ЯОТ обеспечиваются комплексом «классических» нейромедиаторов, включая гамма-аминомасляную кислоту (ГАМК), серотонин, глицин, глутамат, пептиды, а также их специфические рецепторы. Одним из основных нейротрансмиттеров является тормозный - ГАМК. У взрослых животных в ЯОТ ГАМК-ергические нейроны диффузно рассеяны и обнаруживаются на всей площади каудальной части ядра, а непосредственно в вентролатеральной части ЯОТ выявлены ГАМК-ергические терминали и синапсы [2, 3, 7]. Данные, полученные в результате физиологических экспериментов, показали, что передача импульсов, опосредованная ГАМК, оказывает сильное тормозное действие на деятельность нейронов ЯОТ и более того играет важную роль в поддержании нормального ритма дахания как у взрослых, так и у новорожденных животных [12, 16]. Считают, что вентролатеральная часть ЯОТ играет центральную роль в контроле фаз респираторного цикла, однако мало известно о формировании здесь локальной нейральной тормозной сети в ранний постнатальный период, когда происходит созревание респираторной функции у млекопитающих животных и человека. Установлено, что у взрослых животных ГАМК-и серотонинергическая (5-НТ) системы оказывают влияние на многие популяции нейронов продолговатого мозга, регулируя общий нейротрансмиттерный гомеостаз в этой области [15, 18]. Показано, что не только ГАМК регулирует активность нейронов вентролатеральной части ЯОТ, участвующих в респираторном процессе, но и непосредственно серотонин через проекции из каудальных 5-НТ-ергических ядер шва с вовлечением рецепторного звена 5-HT1A и 5-HT1B [15, 18]. Однако крайне мало известно о влиянии серотонина на становление тормозной ГАМКергической сети и механизмах синтеза ГАМК, а также контроля передачи его опосредованных импульсов в респираторных ядрах в период раннего развития. В связи с этим целью настоящей работы было изучить динамику формирования тормозной ГАМК-ергической системы в раннем постнатальном периоде в норме и при пренатальном дефиците серотонина. Материал и методы. Исследование проведено на крысах линии Вистар. Содержание животных и все экспериментальные процедуры осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ № 755 от 12.08.1977 г. МЗ СССР). Уровень эндогенного серотонина снижали путем ингибирования триптофангидроксилазы (фермента его синтеза) пара-хлорфенилаланином (пХФА) (Sigma, США). пХФА в дозе 400 мг/кг самкам крыс вводили внутрибрюшинно на 9-е сутки беременности, при этом снижение содержания серотонина до 50-80% происходило в период формирования у плодов собственной серотонинергической системы [1, 14]. Головной мозг у родившихся крысят исследовали на 5-, 9-еи 20-е сутки. В качестве контроля использовали животных соответствующих сроков развития, полученных от интактных самок (по 4-5 как контрольных, так и подопытных крысят каждого срока развития - всего 27). Материал фиксировали в цинк-этанол-формальдегиде на фосфатносолевом буфере (рH 7,4), заливали в парафин по общепринятой методике и готовили серийные поперечные срезы продолговатого мозга толщиной 5 мкм на уровне Bregma -12,24, -12,36 мм [17]. Иммуноцитохимическую реакцию для выявления ГАМКергических нейронов проводили с использованием кроличьих поликлональных антител к GAD-67 (Spring Bioscience, США). В качестве вторичных реагентов использовали реактивы из набора EnVision+System-HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit (DakoCytomation, США). Для визуализации продукта реакции применяли хромоген DAB+ (Dako, Дания). После проведения иммуноцитохимической реакции часть срезов докрашивали тионином (Serva, США, Германия) и заключали в синтетическую среду Permaunt (Termo, США). Иммуноцитохимические реакции у контрольных и подопытных животных осуществляли одновременно. Морфологический анализ и морфометрическое исследование проводили на цифровых изображениях серийных срезов, полученных при помощи светового микроскопа Leica DME (Leica, Германия) и цифровой камеры Leica EC3 (Leica, Германия). GAD-67-иммунопозитивные (ИП) нейроны подсчитывали на 8-10 серийных срезах продолговатого мозга (вентролатеральной части ЯОТ), на стандартной площади гистологического среза, равной 0,105 мм² при об. 40, учитывали плотность сети ИП-терминальных отростков в нейропиле и плотность распределения ИП-гранул, которые принято считать синаптическими структурами, их скопления, а также присутствие терминальных варикозных расширений, свидетельствующих о незрелости терминалей [10]. Статистическую обработку полученных показателей осуществляли при помощи прикладных компьютерных программ Statistica 6.0., ImageScope Color и ORIGIN50. Значимость различий определяли по величине t-критерия Стьюдента. Различия считали значимыми при Р<0,05. Результаты исследования. У контрольных животных в вентральном субъядре ЯОТ на 5-е сутки на срезе выявляется 6,3±0,8 GAD-67ИП-нейронов. В нейропиле присутствуют рыхлая сеть ИП-терминалей и одиночные крупные гранулы, располагающиеся как на отростках, так и на телах нейронов (рисунок, а). На 9-е сутки число ИП-нейронов значимо снижается до 1,8±0,6 на срезе. В нейропиле плотность расположения ИП-отростков и гранул немного повышается (см. рисунок, б). Встречаются группы крупных гранул (по 3-4) как на поверхности отростков, так и на телах нейронов. На 20-е сутки число ИП-нейронов невелико и практически соответствует таковому в предыдущий срок исследования - 1,5±0,3 на срезе. В нейропиле присутствуют плотная сеть ИП-отростков и крупные гранулы, которые локализуются на поверхности тел нейронов и на отростках преимущественно группами (см. рисунок, в). В латеральном субъядре ЯОТ на 5-е сутки имеются небольшое число GAD-67-МП-нейронов (4,9±0,8 на срезе), в нейропиле - рыхлая сеть ИП-отростков, мелкие и одиночные крупные гранулы, расположенные на отростках и телах нейронов. На 9-е сутки число ИП-нейронов снижается до 1,1±0,3 на срезе. В нейропиле ИП-отростки образуют более плотную сеть, чем на 5-е сутки, повышается и плотность расположения крупных ИП-гранул, они располагаются как одиночно, так и группами по 3-5 как на отростках, так и на телах нейронов. На 20-е сутки в субъядре насчитывается 0,9±0,7 ИП-нейронов. В нейропиле выявляется плотная сеть ИП-отростков, увеличивается и плотность расположения крупных гранул, локализующихся на поверхности тел нейронов и в нейропиле, где встречаются преимущественно их группы. У животных с пренатальной недостаточностью серотонина на 5-е сутки как в вентральном, так и в латеральном субъядрах ЯОТ на срезе присутствуют 1,7±0,8 GAD-67-ИП-нейронов, в нейропиле - рыхлая сеть ИП-отростков, единичные крупные гранулы, встречаются терминальные варикозные расширения (см. рисунок, г). На телах отдельных нейронов присутствуют от 1-3 гранул. На 9-е сутки в обоих субъядрах на срезе выявляются 1,2±0,6 ИП-нейронов. В нейропиле - рыхлая сеть ИП-отростков (см. рису-нейропиле, так и на телах нейронов. На 20-е сутки нок, д), также, как и в предыдущий срок иссле-в обоих субъядрах ЯОТ ИП-нейроны единичдования, встречаются варикозные расширения ны. В нейропиле - рыхлая сеть ИП-отростков, терминальных отростков, при этом повышается однако, плотность расположения крупных гранул плотность расположения крупных гранул как в близка к таковой в контроле, встречаются они как одиночные, так и образующие группы - по 3-6. На телах почти всех нейронов располагаются группы по 8-10 крупных гранул. Обсуждение полученных данных. Проведенное исследование показало, что в вентральном и латеральном субъядрах ЯОТ в 1-ю неделю постнатального развития имеет место экспрессия ГАМК, о чем свидетельствует присутствие GAD-67-ИП-нейронов, при этом в вентральном субъядре их в 1,3 раза больше, чем в латеральном и, вероятно, интенсивность экспрессии в нем также выше. В течение 2-йи 3-й недели происходит снижение числа GAD-67ИП-нейронов и, видимо, можно предположить снижение экспрессии ГАМК. Одновременно с этим в нейропиле в обоих субъядрах происходит увеличение как плотности сети ИП-терминалей, так и расположения синаптических структур, преимущественно группами локализующихся на отростках и телах нейронов. Полученные данные сравнимы с результатами исследования динамики формирования ГАМК-ергической сети во вкусовых субъядрах, располагающихся в ростральной части ЯОТ [11, 13]. Эти исследователи обнаружили, что в первые 2 нед постнатального развития ГАМК присутствует в цитоплазме многих нейронов субъядер и их отростков, но в нейропиле выявляется незначительное количество терминалей и синапсов, содержащих ГАМК, и предположили, что избыток экспрессии ГАМК и недостаток ГАМК-ергических терминалей и синапсов свидетельствуют о том, что в ранние сроки постнатального развития ЯОТ ГАМК может выполнять не трансмиттерную, а нейротрофическую функцию. Результаты ряда наблюдений [8, 19] показали, что в 1-юи 2-ю неделю постнатального развития имеет место незрелость ГАМК-ергических синаптических структур. Такая незрелость синапсов в ранние сроки развития была подтверждена электрофизиологическими данными. Установлено, что в ростральной части ЯОТ к концу 3-й недели (к 20-м суткам) общий объем экспрессируемой ГАМК снижается, а плотность сети терминалей и плотность расположения синаптических структур, содержащих ГАМК, увеличиваются и соответствуют таковым у взрослых [5, 11]. Результаты нашего исследования согласуются с этими данными и на их основании можно полагать, что формирование тормозной ГАМК-ергической сети в ростральной (вкусовые субъядра) и каудальной (респираторные субъядра) частях ЯОТ происходит сходным образом. Было показано [9], что в ЯОТ элементы тормозной ГАМК-ергической системы появляются еще в пренатальный период. Отдельные ГАМКергические аксонные терминали регистрировались на 20-е сутки внутриутробного развития. Впоследствии происходило постепенное повышение плотности расположения тормозных аксонных терминалей в нейропиле до конца 2-й недели постнатального развития. Появление ГАМКергических синаптических структур было отмечено только после рождения, и затем в течение первых недель постнатального развития происходило увеличение плотности их расположения как в нейропиле, так и на телах нейронов, что также подтверждают наши наблюдения. Результаты нашего исследования показали, что пренатальная недостаточность серотонина оказывает влияние на формирование тормозной системы и в вентральном и латеральном субъядрах. В 1-ю неделю постнатального развития, по сравнению с контролем, присутствует значительно меньшее число GAD-67-ИП-нейронов, следовательно, можно полагать, что и экспрессия ГАМК будет существенно ниже, чем у контрольных животных. В нейропиле к концу 3-й недели, в отличие от контроля, сохраняется рыхлая сеть ИП-терминалей, однако, плотность распределения ГАМК-ергических синаптических структур несколько увеличивается только к концу 3-й недели. Вероятно, дефицит серотонина в пренатальный период может вызывать либо задержку, либо нарушение миграции предшественников ГАМК-ергических нейронов, а также задержку их дифференцировки и, как следствие, формирования сети терминалей и синаптических структур. Более того, у крысят через 2 нед постнатального развития в отличие от контроля обнаруживаются варикозные расширения аксонных терминалей, что свидетельствует о их незрелости [10]. В результате этих изменений, вероятно, происходят снижение экспрессии тормозного трансмиттера ГАМК и значительное нарушение его передачи. Полученные результаты дают основание предположить, что дисфункция серотонин-ергической системы в пренатальный период может быть причиной реорганизации тормозной ГАМКергической системы в дыхательных субъядрах ЯОТ в ранний постнатальный период, являющийся критическим для развивающейся респираторной системы у млекопитающих, и впоследствии вызывать функциональные респираторные нарушения.

About the authors

L. I. Khozhai

RAS I. P.Pavlov of Institute of Physiology

Email: astarta0505@mail.ru

N. V. Ilyichyova

RAS St. Petersburg Institute of Cytology

Email: nad9009@yandex.ru

References

Supplementary files