MORPHOMETRIC PROPERTIES OF DORSAL CLARKE’S NUCLEI IN ROSTRAL SEGMENTS OF LUMBAR PORTION OF SPINAL CORD IN CAT

Full Text

Дорсальные ядра Кларка (nucl. dorsalis) - симметричные относительно центрального канала образования, расположенные на уровне нижних грудных и верхних поясничных сегментов; являются важным элементом дорсального спинно-мозжечкового тракта [4, 11, 13, 4]. В ядра Кларка поступают сенсорные афферентные волокна Ia и II типа от мышечных веретён и Ib типа - от сухожилия, кожные афферентные волокна [10-12]. Эти ядра обеспечивают интеграцию сенсорного и нисходящего кортико-спинального путей [5, 9]. Ядро Кларка было описано более 150 лет назад [7], почти через 100 лет B. Rexed [14] создал атлас спинного мозга кошки, в котором указал положение этого ядра, и до сих пор для стереотаксического доступа к ядру Кларка используется именно этот атлас. Не снижающийся интерес к спинно-мозжечковым взаимодействиям при контроле локомоции и поддержании позы [9, 10], а также использование ядер Кларка в качестве модели для изучения ретроградной дегенерации при поражении спинного мозга [17, 18] диктуют необходимость уточнения морфометрических характеристик этих ядер, что и стало целью данной работы. Материал и методы. Исследование проведено в соответствии с требованиями Директивы Совета Европейского Парламента по защите животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (2010/63EU) и с одобрения комиссии по этике Института физиологии им. И. П. Павлова РАН. В работе использованы образцы спинного мозга 6 взрослых кошек обоего пола. Под глубоким общим наркозом (изофлуран 5% в смеси с кислородом) животные были транскардиально перфузированы последовательно 0,9% раствором натрия хлорида и 4% параформальдегидом на 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,4). Затем спинной мозг извлекали из позвоночного канала и разделяли на сегменты на основании локализации зон входа дорсальных корешков (части сегментов, содержащие корешки, являются их корешковыми зонами). Бескорешковые участки сегментов, расположенные между соседними корешковыми участками, мы относили к более каудальному сегменту. Ядро Кларка исследовали на уровне сегментов LI-LIV. Эти сегменты спинного мозга последовательно пропитывали растворами 20 и 30% сахарозы для приготовления срезов толщиной 50 мкм с помощью замораживающего микротома Leica CM-3050S (Leica, Германия) или растворами этанола восходящей концентрации и петролейным эфиром, после чего заливали в парафин и на микротоме МПС-2 (SM-2010R, Германия) делали срезы толщиной 10 мкм. Локализацию ядер Кларка определяли, используя комплекс методик: 1) гистохимическое выявление ацетилхолинэстеразы (АХЭ), при котором ядра имеют вид локусов с низким уровнем активности фермента [16]; 2) иммуногистохимическое выявление нефосфорилированных доменов тяжёлых цепей нейрофиламентов (антитела SMI-32) - маркёра крупных нейронов и, в частности, клеток ядра Кларка [8]; 3) выявление миелиновых волокон [3, 6]. Первые 2 методики выполняли на замороженных срезах, последнюю - на парафиновых. На поперечных замороженных срезах выявляли АХЭ с помощью модифицированной гистохимической методики Карновского-Рута [15] и нефосфорилированные тяжёлые домены нейрофиламентов антителами SMI-32 с помощью непрямого иммуногистохимического метода. Подробно обе методики описаны ранее [1, 2]. Парафиновые срезы обрабатывали методом Клювера-Барреры, позволяющим комбинировать окраску миелиновых волокон (краситель люксоль синий прочный) с окраской нейронов по методу Ниссля (краситель крезиловый фиолетовый) на одном и том же срезе [3, 6]. После депарафинирования стекла со срезами помещали в 1% спиртовой раствор люксоля синего прочного (Chroma-Gesellschaft Schmidt and Co., Германия) в плотно закрытой посуде в термостат (56 ºС) на 12 ч. Затем промывали последовательно в этаноле и воде и дифференцировали в 0,05% растворе карбоната лития (Sigma-Aldrich, США) до отчетливой визуализации миелиновых волокон, контролируя процесс под микроскопом. После этого срезы промывали в воде, докрашивали подогретым (40 ºС) подкисленным 4,1% раствором крезилового фиолетового (Sigma-Aldrich, США), дифференцировали в этаноле возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заключали под покровные стекла, используя синтетическую среду BioMount (BioOptica, Италия). Оцифровку срезов и морфометрический анализ проводили с помощью установки, оснащенной световым микроскопом Olympus CX41 (Olympus Corporation, Япония) и камерой Canon (Canon Inc, Япония). Начальная обработка изображений включала: контрастирование и обводку контуров. В случае срезов, обработанных по методу Клювера-Барреры, чтобы лучше были видны нейроны на полутоновых изображениях, использовали негативные изображения (инвертированные по яркости). Морфометрический анализ срезов, обработанных для выявления АХЭ, проводили используя программу ImageJ на 14-26 срезах от каждого животного. Изображения срезов выравнивали вдоль медиолатеральной и дорсовентральной осей, после чего определяли пространственные координаты ядер Кларка. Для этого к четырём сторонам ядра проводили касательные, параллельные дорсовентральной и медиолатеральной осям спинного мозга. Затем ядро делили в дорсовентральной плоскости на 3 части; точки пересечения разделяющих линий и перпендикулярных им касательных являлись точками интереса: дорсомедиальной (ДМ), дорсолатеральной (ДЛ), вентромедиальной (ВМ) и вентролатеральной (ВЛ) соответственно (рис. 1, а, б). Началом отсчёта для оси X была середина центрального канала, а для оси Y - дорсальная граница белого вещества. Результаты определения пространственных координат точек ДМ, ДЛ, ВМ и ВЛ для разных половин спинного мозга усредняли. На основании этих данных строили масштабную линейку, позволяющую создать метрические карты сегментов. Контуры сегментов на этих картах, равно как и границы ядер Кларка, получали, усредняя контуры и границы всех срезов данного сегмента у 5 животных. Исследования проведены с использованием оборудования Ресурсного центра молекулярных и клеточных технологий Санкт-Петербургского государственного университета. Результаты исследования. На поперечных срезах при гистохимическом выявлении АХЭ ядро Кларка выглядит как светлая область, лишённая продукта реакции (см. рис. 1, в; 2, б-е). На срезах, меченных антителами SMI-32, ядро Кларка содержит интенсивно окрашенные крупные нейроны, большинство которых локализуются в ВМ его части, а границы ядра четкие благодаря замкнутому кольцу неокрашенных волокон (см. рис. 2, г). На срезах, окрашенных по методу Клювера-Барреры, видно, что это кольцо состоит из безмиелиновых или слабо миелиновых волокон (см. рис. 1, д). Внутри этого кольца находятся пучки поперечно срезанных волокон с толстой миелиновой оболочкой, особенно плотно расположенные в ДЛ части ядра. Большинство нейронов, докрашенных крезиловым фиолетовым, на этих срезах так же, как и при выявлении SMI-32 клетки, были обнаружены в ВМ-части ядра (см. рис. 1, е). Таким образом, приступая к составлению метрических карт серого вещества спинного мозга и ядер Кларка, мы были уверены в точности их локализации. Поскольку наиболее чётко ядро Кларка выявляется с помощью реакции на АХЭ, метрические карты мы строили на базе срезов, обработанных именно по этой методике. Первое, что бросается в глаза при сопоставлении срезов разных сегментов спинного мозга, это изменение положения ядра в пространстве серого вещества. В сегментах LI- LIII ядра Кларка правой и левой сторон спинного мозга расположены почти прямо на срединной границе, от которой они отделены узкой полоской волокон (см. рис. 1, в; 2, б-г) (это подтверждается при использовании метода Клювера-Барреры, см. рис. 1, г). Между ядрами и дорсальным краем серого вещества в области срединной линии на большинстве срезов видны слой волокон и тонкая полоска серого вещества. На более каудальных уровнях мозга ядра смещаются в латеральном направлении (см. рис. 2, д, е). Поскольку в рострокаудальном направлении происходит расширение спинного мозга (см. рис. 2, а), это приводит к изменению формы ядер: от шаровидной - на уровне LI-LII до эллиптической (или даже линзовидной) - на уровне LIV. Наибольшие изменения формы имеются именно в этом сегменте (см. рис. 2, д, е). Вместе с трансформацией контура серого вещества меняется и ориентация длинной оси ядер Кларка: они становятся направленными под всё более острым углом к срединной линии. Вместе взятые, эти факторы значительно затрудняют картирование ядер Кларка в электрофизиологическом эксперименте. Для уточнения локализации ядрá мы исследовали динамику изменения пространственных координат точек ДМ, ДЛ, ВМ и ВЛ в разных сегментах спинного мозга. Значение координаты X отражает расстояние между этими четырьмя точками и центральным каналом; значение координаты Y - расстояние между точками и дорсальной границей белого вещества. Расстояние между центральным каналом и точками ДЛ/ВЛ нарастает почти линейно, а точками ДМ/ВМ - по экспоненте (см. рис. , ж). Расстояние между точками ДМ, ДЛ, ВМ и ВЛ и дорсальной границей белого вещества меняется слабо; увеличение расстояния выявлено только для точки ДМ (см. рис. 2, з). Эти данные подтверждают факт поворота длинной оси ядра Кларка и его смещения в ДЛ-направлении в сегменте LIV. Получены итоговые метрические карты сегментов LI-LIV спинного мозга, построенные на базе усреднённых контуров срезов разных сегментов спинного мозга и усреднённых (рис. 3) пространственных координат четырех реперных точек у 5 кошек. Обсуждение полученных данных. В результате проведенной работы составлены метрические карты поперечных срезов спинного мозга на уровнях первых четырёх поясничных сегментов с нанесёнными на них границами ядер Кларка. Эти карты отличаются от известных карт B. Rexed [14] по двум пунктам. Во-первых, мы показали, что на наиболее ростральном уровне поясничного отдела (сегменты LI-LII) ядра Кларка двух половин cпинного мозга разделены лишь волокнами; от дорсального края серого вещества они отделены узкой полоской серого вещества. При этом на схеме B. Rexed [14] между медиальными границами соседних ядер расположена пластина X, а между ядрами и дорсальным краем серого вещества - довольно широкая (составляющая 1/3-1/2 от высоты ядра Кларка) пластина V. Во-вторых, в отличие от B. Rexed [14], показавшего уменьшение медиолатеральной протяжённости ядер Кларка в сегментах LIII и LIV, мы выявили её приращение, а также уплощение ядер и их смещение в ДЛ-направлении. Эти отличительные особенности очевидны при использовании методик выявления АХЭ, миелина и нейрофиламентов. В работе M. Aoyama и соавт. [4] нейроны, посылающие волокна в мозжечок, были показаны за пределами «классических» границ ядра Кларка: в частности, в сером веществе дорсальнее центрального канала (т. е. в пластине V по B. Rexed [14]). Полагаем, что это является ещё одним свидетельством в пользу того, что дорсальная граница ядер Кларка на схеме B. Rexed [14] была смещена в вентральном направлении. Рассчитываем, что представленная схема будет способствовать более точному стереотаксическому доступу к ядрам Кларка и поможет при их изучении в фундаментальных и прикладных исследованиях. Работа проведена при поддержке гранта РФФИ (РФФИ грант № 16-04-01791-А) и Российского Научного Фонда (РНФ грант № 14-15-00788, анализ материалов, полученных с использованием иммуногистохимического маркера нефосфорилированных доменов тяжёлых цепей нейрофиламентов, проводимый Вещицким А. А.). Коллектив авторов благодарит проф. R. Veh (Institut für Anatomie der Charité, Humboldt-Universität Berlin, Germany) за помощь при постановке гистохимического метода выявления ацетилхолинэстеразы. Авторы также благодарят Е. Ю. Баженову и Н. В. Павлову за помощь в обработке гистологического материала, а также М. А. Кутуеву за помощь при работе с животными.

About the authors

N. S. Merkulyeva

I. P. Pavlov Institute of Physiology

Email: mer-natalia@yandex.ru

A. A. Veshchitskiy

I. P. Pavlov Institute of Physiology

Email: veschickiyalex@mail.ru

P. Yu. Shkorbatova

I. P. Pavlov Institute of Physiology

Email: polinavet@yandex.ru

B. S. Shenkman

Email: bshenkman@mail.ru

P. E. Musienko

Research Institute of Phthisiopulmonology; Institute of Biomedical Problems

Email: pol-spb@mail.ru

F. N. Makarov

I. P. Pavlov Institute of Physiology

Email: felixmakarov@mail.ru

References

Supplementary files