HISTOLOGICAL AND MORPHOMETRIC CHARACTERISTIC OF THE ARTICULAR CARTILAGE LONG TIME AFTER MODELING OF OSTEOARTHRITIS FOLLOWED BY TUNNELING OF THE SUBCHONDRAL AREA AND AUTOLOGOUS BONE MARROW INJECTION

Full Text

Решению медико-социальных проблем остеоартроза (ОА) во всем мире придается большое значение. Медикаментозная терапия и его хирургическое лечение продолжают совершенствоваться и обновляться [13], Однако доля больных с ОА практически не снижается, что указывает на необходимость продолжения поиска новых, более эффективных методов лечения ОА с учетом современных представлений о патогенезе этого заболевания. Обоснование роли субхондральной кости в его патогенезе привело к разработке новых технологий лечения, точкой приложения которых являлась не только хрящевая, но и костная ткань [1, 13, 15]. В настоящее время в клинике широко применяют модифицированные методики субхондральной туннелизации [4, 5, 14]. Проведенные нами ранее исследования в сроки от 14 до 90 сут после моделирования ОА показали, что субхондральная туннелизация с введением аутологичного костного мозга оказывает стимулирующее воздействие на регенерацию суставного хряща [8]. Несмотря на то, что остеоперфоративные вмешательства при повреждениях суставного хряща относят к группе операций, стимулирующих регенерацию последнего, оценка их результативности остается неоднозначной. Различия трактовки результатов, видимо, связаны с отсутствием унифицированных и дифференцированных подходов к их оценке и с краткосрочностью наблюдений [13]. В качестве критерия оценки результативности методики субхондральной туннелизации в эксперименте может служить морфометрическая характеристика суставного хряща, дающая представление о функциональной активности хрящевых клеток. Цель настоящего исследования - гистологическая и морфометрическая характеристика суставного хряща в отдаленные сроки после моделирования ОА с последующей туннелизацией субхондральной зоны и введением в каналы аутологичного костного мозга. Материал и методы. Исследования выполнены на 12 беспородных собаках обоего пола массой 12-15 кг в возрасте 1,5-2 года. Содержание животных, оперативные вмешательства и эвтаназию проводили в соответствии с требованиями МЗ РФ к работе экспериментально-биологических клиник, а также «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей». Все манипуляции, проводимые на животных, были рассмотрены и одобрены этическим комитетом «Российского научного центра “Восстановительная травматология и ортопедия” им. академика Г. А. Илизарова» (протокол № 6 от 02.12,2014 г.). Всем животным предварительно моделировали ОА путем пересечения бедренной артерии с последующей иммобилизацией обоих коленных суставов (период иммобилизации - 28 сут) по разработанному нами способу [7]. Морфологическое исследование сустава подтвердило адекватность полученной модели [3, 12]. Экспериментальный материал разделен на 3 серии: в 1-й серии (8 суставов) после моделирования ОА туннелизацию не проводили; во 2-й серии (8 суставов) после окончания периода иммобилизации вне сустава туннелировали субхондральную зону, в каждом мыщелке бедренной и большеберцовой кости делали по 4 туннеля, в 3-й серии (8 суставов), как и во 2-й серии вне сустава туннелировали субхондральную зону, в каждый канал вводили по 0,2 мл костномозговой суспензии, взятой из проксимального метафиза плечевой кости. Животных выводили из опыта через 6 мес и 1 год после моделирования ОА. В качестве контроля (нормы) исследовали суставной хрящ 5 интактных животных. Морфометрические исследования проведены на серийных полутонких срезах суставного хряща с подлежащей субхондральной костью большой площади (до 8 мм2) [10], которые окрашивали метиленовым синим-основным фуксином. Изображения микропрепаратов оцифровывали на АПК «ДиаМорф» (Россия) и анализировали, используя программу «ВидеоТест-Мастер-Морфология». Определяли толщину суставного хряща (h, мкм), объемную плотность хондроцитов (VVхц, %) в ткани, численную плотность хондроцитов (NА, мкм-2), долю (%) пустых лакун (NA) и изогенных групп (NA) в общем объёме выборки из 200 хондроцитов, рассчитывали ядерно-цитоплазматический индекс хондроцитов (ЯЦИ). Цифровой материал анализировали по критериям вариационной и непараметрической статистики в программе AtteStat, версия 1.0 в электронных таблицах Microsoft Excel 97. Результаты исследования. При исследовании суставного хряща у животных 1-й серии через 6 мес после моделирования ОА выявлено разволокнение поверхностной зоны (рис. 1, а). Через 1 год очаги разволокнения захватывали всю поверхностную зону и бóльшую часть промежуточной зоны (см. рис. 1, б). В очагах разволокнения отмечены демаскировка коллагеновых волокон, что свидетельствовало о прогрессирующем снижении содержания сульфатированных гликозаминогликанов в матриксе хряща и фрагментация демаскированных коллагеновых волокон, хондроциты были аномальной формы, имелись пустые клеточные лакуны. На протяжении всего эксперимента во всех зонах хряща размеры хрящевых клеток были уменьшены и занимали не всю лакуну. Основная часть хондроцитов были с признаками деструкции, клетки имели в основном мелкие, часто пикнотически сморщенные ядра и скудную цитоплазму, ЯЦИ составлял 0,730±0,010 (в контроле ЯЦИ - 0,420±0,010). Была увеличена доля бесклеточных полей. Во всех зонах выявлены пустые лакуны. В глубокой зоне хряща нарушена цитоархитектоника, хондроциты располагались одиночно, редко в виде двуклеточных изогенных групп. На бóльшем протяжении базофильная линия была местами утолщена, в отдельных участках нарушалась ее непрерывность. В таких участках отсутствовала зона кальцифицированного хряща, было отмечено проникновение сосудов в глубокую зону хряща. С увеличением срока эксперимента прогрессировало снижение морфометрических параметров: толщины хряща (h), объемной плотности хондроцитов (VVхц) (таблица), ЯЦИ составил 0,530±0,010. К концу эксперимента пролиферативная активность хондроцитов была подавлена, значительно снижена доля изогенных групп в общем объеме выборки, при этом сохранялась большая доля пустых лакун (см. таблицу). Во 2-й серии через 6 мес после моделирования ОА в суставном хряще сохранялось разволокнение межклеточного вещества суперфициальной части поверхностной зоны (рис. 2, а). Во всех зонах отмечены пустые лакуны. Репаративная регенерация хряща выражалась в возрастании количества клеток, размеры которых были увеличены, они имели округлую форму, светлые гомогенные ядра, базофильную цитоплазму, ЯЦИ таких клеток составлял 0,350±0,020. По сравнению с 1-й серией наблюдалось снижение NАхц, но за счет увеличения размеров хондроцитов была выявлена тенденция к увеличению VVхц. Сохранялась большая доля пустых лакун, почти в 2 раза по сравнению с нормой было снижено относительное содержание изогенных групп. Толщина хряща значимо превышала таковую в 1-й серии. Через 1 год после моделирования ОА репаративные процессы преобладали над деструктивными, матрикс поверхностной зоны был гомогенным (см. рис. 2, б), очаги разволокнения не выявлены, целостность базофильной линии не нарушена. Отмечено увеличение объемной плотности хондроцитов (VVхц) по сравнению с таковой в предыдущий срок эксперимента ив 1-й серии опытов, что было обусловлено как увеличением численной плотности хондроцитов (NАхц) по сравнению с данным параметром в предыдущий срок эксперимента, так и увеличением размеров хондроцитов, ЯЦИ был 0,320±0,010. По сравнению с 1-й серией значимо была снижена доля пустых лакун, увеличено относительное содержание изогенных групп хондроцитов. Толщина хряща продолжала увеличиваться и значимо превышала таковую в 1-й серии, по сравнению с нормой сохранялись сниженные значения (см. таблицу). В 3-й серии в суставном хряще через 6 мес после моделирования ОА очаги разволокнения отсутствовали, была восстановлена гомогенность матрикса поверхностной зоны, целостность базофильной линии не нарушена (рис. 3, а). По сравнению со 2-й серией выявлено значимое увеличение численной и объемной плотностей хондроцитов, толщины хряща, ЯЦИ был снижен до 0,280±0,010. Доля пустых лакун и изогенных групп были сопоставимы со значениями у интактных животных. Через 1 год после моделирования ОА в поверхностной зоне преобладали клетки с признаками повышенной биосинтетической активности: размеры их были увеличены, они имели округлую форму, светлое гомогенное ядро и базофильную цитоплазму, ЯЦИ был равен 0,260±0,010. В промежуточной зоне отмечено появление 2-, 3-, 4-клеточных изогенных групп. Целостность базофильной линии не нарушена (см. рис. 3, б). По сравнению с соответствующими показателями в предыдущий срок эксперимента было выявлено увеличение численной и объемной плотностей хондроцитов, доли изогенных групп. Толщина хряща и объемная плотность хондроцитов превышали аналогичные параметры в 1-йи 2-й сериях опытов и были сопоставимы с таковыми у интактных животных (см. таблицу). Обсуждение полученных данных. Таким образом, в отдаленные сроки эксперимента в нетуннелированных суставах отмечен нарастающий артроз. Значительно увеличена доля пустых лакун, при этом снижено относительное содержание изогенных групп, размеры хондроцитов уменьшены, наблюдаются признаки деструкции, что свидетельствует о прогрессировании деструктивных процессов. Закономерным выглядело снижение толщины хряща. Поскольку хондроциты - единственный тип клеток, формирующих хрящ и поддерживающих динамическое равновесие между синтезом и деградацией внеклеточного матрикса [6], восстановительные процессы определяются, прежде всего, степенью активации биосинтетической активности выживших хондроцитов, их пролиферации, постпролиферативного восстановления биосинтетической активности и участием в реорганизации матрикса. При данном патологическом процессе собственные регенераторные возможности суставного хряща подавлены и его восстановление невозможно без дальнейшего потенцирования внешних по отношению к хрящу механизмов. Возрастание доли изогенных групп в сочетании с увеличением размеров хондроцитов в суставном хряще животных 2-йи 3-й серий могут быть расценены как реактивные изменения адаптационного генеза, за счет которых осуществлялась репаративная регенерация хряща. Известно, что функционально активные клетки больше по размерам и имеют округлую форму [2]. Увеличение числа активно пролиферирующих клеток - основной источник восстановительных процессов в суставном хряще [6]. Выявленные отличия морфометрических параметров в 1-й серии по сравнению с таковыми во 2-йи 3-й сериях позволяют предположить, что в отдаленные сроки после моделирования ОА в условиях туннелизации в суставном хряще уменьшаются дегенеративные изменения и гибель клеток, что проявляется снижением доли пустых лакун в выборке хондроцитов и отсутствием очагов разволокнения матрикса. В экспериментах по удлинению голени нами было показано, что увеличение доли изогенных групп в суставном хряще сопровождается экспрессией маркера пролиферативной активности Ki-67 [11]. Увеличение численности изогенных групп, объемной плотности хондроцитов, снижение ЯЦИ и восстановление тинкториальных характеристик хряща и его толщины свидетельствовали о повышении пролиферации и биосинтетической активности хондроцитов. В проведенных ранее исследованиях в сроки эксперимента от 14 до 90 сут после моделирования ОА показано, что при туннелизации субхондральной зоны стимуляция регенерации суставного хряща осуществляется путем коррекции гомеостаза хряща и субхондральной кости и улучшения трофики тканей [9].

About the authors

T. A. Stupina

G.A. Ilizarov Russian Scientific Center for Restorative Traumatology and Orthopedics

Email: StupinaSTА@mail.ru

M. A. Stepanov

G.A. Ilizarov Russian Scientific Center for Restorative Traumatology and Orthopedics

Email: m-stepanov@mail.ru

M. P. Tyoplenkiy

G.A. Ilizarov Russian Scientific Center for Restorative Traumatology and Orthopedics

Email: TeplenkiyMP@mail.ru

References

Supplementary files