СИНАПТОГЕНЕЗ В РАЗВИВАЮЩЕМСЯ МОЗЖЕЧКЕ КРЫСЫ

Полный текст

Развитие мозжечка в онтогенезе сопровождается пролиферацией, миграцией, дифференцировкой нейронов, формированием между ними синаптических связей. Предшественники клеток Пуркинье (КП) формируются на 13-16-е сутки эмбриогенеза крысы в вентрикулярном слое крыши IV желудочка, а затем мигрируют в радиальном направлении, сначала образуя в будущей коре мозжечка многорядный слой и только к 3-4-м суткам постнатального развития - однорядный. Образование синапсов между КП и параллельными волокнами (аксонами зернистых нейронов) начинается в глубокой части молекулярного слоя коры мозжечка на 7-9-е сутки постнатального периода онтогенеза [9]. У крыс корзинчатые нейроны образуются со 2-х по 17-е сутки постнатального развития, а звездчатые нейроны - с 4-х по 19-е сутки. Затем они дифференцируются и образуют синаптические контакты с КП [14]. Лазящие волокна (аксоны нейронов нижней оливы) достигают коры развивающегося мозжечка и устанавливают синаптические контакты с КП к 18-19-м суткам эмбрионального развития. Затем к 15-м суткам постнатального развития множественная иннервация лазящими волокнами к моменту рождения сменяется моноиннервацией [5]. Моховидные афферентные волокна во внутреннем зернистом слое (ВЗС) мозжечка формируют клубочки. Существуют несколько источников моховидных волокон: нейроны спинного мозга (волокна спиноцеребеллярного пути, которые проникают в мозжечок на 15-е сутки эмбрионального развития), вестибулярные ядра (вестибулоцеребеллярные афферентные волокна - 13-15-е сутки), ядра ретикулярной формации (ретикулоцеребеллярные проекции на 16-17-е сутки), ядра тройничного нерва (на 22-е сутки внутриутробного развития) и ядра моста (понтоцеребеллярные афферентные волокна - после рождения) [12]. В ходе дифференцировки клубочков мозжечка различают 2 этапа: протогломерулярный и гломерулярный. Первый этап проходит у крыс в течение первых 2 нед постнатального развития и характеризуется быстрым расширением розеток моховидных нервных волокон, содержащих синаптические пузырьки вблизи плазмолеммы. Второй этап (гломерулярный) - формирование и стабилизация клубочков - с 15-х по 45-е сутки. В этот период происходит увеличение в терминалях моховидных волокон числа синаптических пузырьков и контактов с дендритами зернистых клеток, которые образуют выпячивания (шипики), содержащие митохондрии и цистерны эндоплазматической сети [2]. Эфферентные пути мозжечка (образованы аксонами КП) начинают формироваться в позднем периоде эмбриогенеза, и КП устанавливают синаптические контакты с клетками-мишенями (нейронами ядер мозжечка) к 20-м суткам внутриутробного развития [7]. Охарактеризовать синаптогенез в ходе развития мозжечка позволяет молекулярный маркер синаптических пузырьков синаптофизин (СФ) [1, 3, 11]. СФ составляет 10% от всех белков синаптических пузырьков, обеспечивает их контакт с пресинаптической мембраной, участвует в эндо-и экзоцитозе нейромедиаторов [10]. Эмбриональный СФ отличается по своим биохимическим свойствам от СФ взрослых животных [6]. Присутствие СФ не является обязательным для образования синаптических пузырьков [8]. В настоящее время считают, что при отсутствии СФ не происходит изменения экзоцитоза медиатора, но после передачи нервного импульса нарушается эндоцитоз и замедляется заполнение синаптических пузырьков медиатором, что ограничивает возможности передачи нервных импульсов нейронами [10]. СФ синтезируется в перикарионах, а затем поступает в аксоны нейронов [9]. Экспрессия СФ в молекулярном слое мозжечка главным образом обусловлена синаптическими контактами между дендритами КП и параллельными волокнами, а в зернистом слое - с моховидными волокнами [11]. Цель настоящего исследования - оценка синаптогенеза в развивающемся мозжечке крысы с помощью иммуногистохимического выявления СФ. Материал и методы. Эксперименты выполнены на потомстве самок беспородных белых крыс с исходной массой 180±20 г. Все опыты проведены с учетом «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». На данное исследование получено разрешение комитета по биомедицинской этике Гродненского государственного медицинского университета (протокол № 7 от 23. 12. 2013 г.). Животные находились на стандартном рационе вивария. От каждой самки брали по одному крысенку по достижении ими 2-, 7- 15-хи 45-х суток после рождения и декапитировали (всего изучено 12 крысят). Для получения сопоставимых результатов от всех животных образцы мозжечка обрабатывали параллельно и в одинаковых условиях. Их фиксировали в цинк-формалине при 4 ºС (в течение ночи), а затем заливали в парафин. Срезы толщиной 7 мкм готовили с помощью микротома Leica RM 2125 RTS (Leica, Германия). Для иммуногистохимического выявления СФ применяли первичные поликлональные кроличьи антитела Synaptophysin Antibody (РА5-27286) (Thermo Scientific, США) в разведении 1:400 при 4 ºС, экспозиция 20 ч, во влажной камере. Для выявления связавшихся первичных антител использовали набор Thermo Scientific (США) Super Picture™ Polymer Detection Kit. Расположение филогенетически древней (paleocerebellum) и новой (neocerebellum) частей мозжечка на гистологических препаратах развивающегося мозжечка крысят определяли на основании данных С. Н. Оленева [4], используя атлас G. Paxinos и C. Watson [13]. Изучение гистологических препаратов, микрофотографирование и морфометрическое исследование проводили с помощью микроскопа Axioscop 2 plus (Zeiss, Германия), цифровой видеокамеры LeicaDFC 320 (Leica, Германия) и программы анализа изображения ImageWarp (Bitflow, США). У крысят определяли плотность расположения клубочков мозжечка на 1 мм2 ВЗС, ширину зоны синаптогенеза и экспрессию СФ в молекулярном слое коры мозжечка, количество синапсов вокруг перикарионов КП, экспрессию СФ в нейропиле промежуточного ядра. Средние значения, полученные у животных в каждой экспериментальной группе, анализировали методами непараметрической статистики с помощью программы Statistica 6.0 для Windows (StatSoft, Inc., США). В описательной статистике для каждого показателя определяли значения медианы (Ме) и интерквартильного диапазона (IQR). Результаты исследования. В коре мозжечка крыс на 2-еи 15-е сутки после рождения в наружных рядах наружного зернистого слоя (НЗС), которые образованы делящимися клетками - предшественниками зернистых нейронов, окраска при реакции на СФ отсутствует. В цитоплазме готовящихся к миграции и мигрирующих через молекулярный слой будущих зернистых нейронов она выявляется (рис. 1, а-в). Иммунореактивность СФ присутствует и в цитоплазме зернистых нейронов ВЗС, но с возрастом (на 15-45-е сутки) она снижается (см. рис. 1). На 7-е сутки у контрольных крыс как в древней, так и в новой части мозжечка при реакции на СФ окрашивание синапсов наблюдается в виде плотно расположенных точек между перикарионами КП и в глубокой части молекулярного слоя (рис. 2, б). На 15-е и особенно 45-е сутки постнатального онтогенеза у крыс по мере утолщения молекулярного слоя в обеих частях мозжечка ширина зоны синаптогенеза увеличивается (табл. 1). При этом СФ-иммунопозитивные синапсы становятся более мелкими, многочисленными и расположены равномернее на иммунонегативных дендритах КП, чем на 7-е сутки, а окрашивание зоны синаптогенеза становится более гомогенным и слабым (см. рис. 1, табл. 1), за исключением полосы повышенной иммунореактивности на поверхности молекулярного слоя на 45-е сутки (см. рис 1, г). На 2-еи 7-е сутки после рождения экспрессия СФ наблюдается между перикарионами КП (см. рис. 1, а). На 7-е сутки СФ-иммунопозитивные синапсы в виде многочисленных крупных, интенсивно окрашенных точек видны вокруг перикарионов клеток Пуркинье - формирующиеся аксосоматические синапсы. На 15-45-е сутки после рождения количество аксосоматических синапсов на перикарионах КП значительно уменьшается. В эти сроки количество крупных СФ-позитивных синапсов на перикарионах КП в древней и новой части мозжечка составляет всего 2,0±1,0 (Ме±IQR). В этот период преобладают мелкие СФ-иммунопозитивные аксосоматические синапсы, выглядящие как мелкая пылевидная зернистость. Иммунореактивность СФ выявляется и в цитоплазме КП: на 2-е сутки она слабая, резко возрастает, достигая максимума на 7-е сутки, а затем постепенно уменьшается. При этом перикарионы КП хорошо выделяются на фоне светлого нейропиля со слабой иммунореактивностью (см. рис. 1, в, г). В формирующемся ВЗС на 2-е сутки постнатального онтогенеза у крыс иммунореактивность СФ слабая и проявляется мелкой зернистостью, не отличающейся от таковой в белом веществе. На 7-е сутки среди зернистых нейронов равномерно располагаются преимущественно мелкие СФ-иммунопозитивные точки - по-видимому, терминали моховидных волокон, являющихся основой для формирования будущих клубочков мозжечка (см. рис. 2, б). На 15-е сутки равномерно среди зернистых клеток определяются СФ-иммунопозитивные мелкие и среднего размера формирующиеся клубочки мозжечка (см. рис. 2, в). К 45-м суткам число крупных СФ-позитивных клубочков с очень высокой иммунореактивностью возрастает, а мелких - уменьшается (см. рис. 1, в; табл. 2). При этом общее количество (плотность расположения) клубочков во ВЗС не меняется (см. табл. 2). В промежуточном ядре мозжечка на 2-е сутки после рождения на перикарионах нейронов наблюдаются лишь единичные СФ-иммунопозитивные точки - аксосоматические синапсы. Преобладают нейроны с малым количеством аксосоматических синапсов, нейроны с плотно расположенными синапсами единичны. В нейропиле равномерно расположены многочисленные мелкие аксодендритные синапсы. На 7-45-е сутки вокруг перикарионов некоторых нейронов образуются темные ободки из плотно расположенных аксосоматических синапсов (см. рис. 2). В промежутке между 7-ми и 4-ми сутками в нейропиле размеры аксодендритных синапсов увеличиваются, и они начинают располагаться неравномерно, образуя скопления (см. рис. 2). При этом общая иммунореактивность нейропиля в промежуточном ядре мозжечка в динамике постнатального онтогенеза не меняется (табл. 3). ИммунореактивностьСФв Обсуждение полученных данных. цитоплазме нейронов этого ядра умеренная, гомо-Отсутствие иммунореактивности СФ в наружных генная и не меняется на протяжении всех сроков рядах НЗС на 2-15-е сутки после рождения свинаблюдения (см. рис. 2). детельствует об экспрессии этого гликопротеина В белом веществе мозжечка СФ-иммунореак-в цитоплазме и отсутствии нервных терминалей в тивность выявляется на 2-е и меньше на 7-е сутки зоне пролиферации предшественников зернистых постнатального развития, что особенно отчетли-нейронов. Однако иммунореактивность выявляетво видно в Crus I на 7-е сутки после рождения. ся в цитоплазме премиграторных и мигрирующих В дальнейшем она исчезает. предшественников зернистых нейронов. Это подтверждается тем, что в нейронах НЗС, находящихся в премиграторной зоне, СФ локализуется в транслатеральных цистернах комплекса Гольджи и возле него в синаптически-подобных пузырьках и сохраняется в этих же нейронах, мигрирующих через молекулярный слой [9]. В нашем исследовании при иммуногистохимической реакции на СФ окрашивание было выявлено на 2-е сутки постнатального онтогенеза вокруг перикарионов КП и в формирующемся молекулярном слое. В литературе описано, что при электронно-микроскопическом исследовании первые синапсы в молекулярном слое наблюдаются уже на 19-е сутки внутриутробного развития [15]. Возможно, это окончания моховидных волокон на КП, входящих в мозжечок еще до рождения. Контакты с ними являются временными, когда зернистый слой созревает, моховидные волокна вытесняются с КП и устанавливают синапсы с дендритами зернистых нейронов [12]. Увеличение ширины зоны синаптогенеза и уменьшение в ней СФ-иммунореактивности с 7-х по 45-е сутки после рождения, по-видимому, связано с ростом дендритного древа КП. Уменьшение количества СФ-иммунопозитивных синапсов вокруг перикарионов КП с 7-х по 15-е сутки может быть обусловлено элиминацией избыточной иннервации лазящими волокнами и формированием ими синапсов с дендритами КП. В ВЗС на 2-7-е сутки постнатального онтогенеза мелкозернистая СФ-иммунореактивность, вероятно, обусловлена колбами роста и терминалями моховидных волокон, а на 15-45-е сутки формирующимися клубочками мозжечка [2], которые выглядят как более крупные участки высокой СФ-иммунореактивности. Увеличение количества СФ-позитивных синапсов на перикарионах нейронов промежуточного ядра мозжечка в постнатальном онтогенезе очевидно связано с формированием терминалей эфферентных волокон, идущих от КП, и по срокам соответствует данным литературы [7]. Кроме того, на нейронах ядер мозжечка заканчиваются коллатерали моховидных и лазящих волокон, а также многослойные (нейромодулирующие) волокна. К последним относятся: серотонинергические (формируются постнатально), норадренергические (проникают в мозжечок на 17-е сутки внутриутробного развития), а также холинергические, дофаминергические и гистаминергические [12]. При этом, по нашим данным, общая экспрессия СФ в нейропиле промежуточного ядра мозжечка у крыс в постнатальном онтогенезе не меняется, что связано с укрупнением синапсов и уменьшением их числа (плотности расположения). Выявленная иммунореактивность СФ в белом веществе на 2-7-е сутки после рождения, вероятно, обусловлена конусами роста развивающихся афферентных волокон. Известно, что синаптические пузырьки образуются в телах нейронов, транспортируются по растущим аксонам и накапливаются в конусах роста ещё до начала синаптогенеза [9]. Это объясняет присутствие умеренной СФ-иммунореактивности и в цитоплазме перикарионов, но не в ядрах нейронов мозжечка (КП, зернистые нейроны, нейроны ядер). Таким образом, иммуногистохимическое исследование динамики экспрессии СФ является эффективным способом оценки синаптогенеза в мозжечке в раннем постнатальном периоде онтогенеза. Этот подход может быть использован и при изучении влияния на этот процесс различных экспериментальных воздействий и патологических состояний.

Об авторах

Сергей Михайлович Зиматкин

Гродненский государственный медицинский университет

Email: smzimatkin@grsmu.by
кафедра гистологии, цитологии и эмбриологии 230015, г. Гродно, ул. Горького, 80

Ольга Анатольевна Карнюшко

Гродненский государственный медицинский университет

Email: karnyushko-olga@mail.ru
кафедра гистологии, цитологии и эмбриологии 230015, г. Гродно, ул. Горького, 80

Список литературы

Дополнительные файлы