METHOD FOR MORPHOLOGICAL AND MORPHOMETRIC ANALYSIS OF HUMAN TOOTH ENAMEL USING ATOMIC FORCE MICROSCOPY

Full Text

Для понимания изменений, происходящих на поверхности эмали зуба, необходимо использование методов исследования, позволяющих изучать её ультраструктурные особенности, не нарушая первоначальный рельеф [6]. В последнее время с этой целью как зарубежными [15-18], так и отечественными [9, 14] исследователями широко используется атомно-силовая микроскопия (АСМ). Интерес к изучению микроструктуры, топологии твердых тканей зуба обусловлен не только их уникальными свойствами, но и желанием прогнозировать, моделировать и корректировать их изменения под влиянием различных факторов с целью достижения стабильных результатов лечения основных стоматологических заболеваний [4, 5, 7, 12, 19, 20]. Однако до сих пор не выработаны единые критерии, позволяющие сопоставлять полученные результаты АСМ-изображений. Цель исследования - разработать методику АСМ-исследования поверхности эмали зуба человека и определить критерии, позволяющие применять морфологический и морфометрический анализ для объективной оценки, полученных с помощью АСМ-изображений. Была исследована поверхность эмали 24 интактных зубов человека (12 - резцов и 12 - моляров), удаленных по ортодонтическим показаниям у пациентов от 17 до 30 лет. Сбор материала осуществляли в соответствии с требованиями «Этической экспертизы биомедицинских исследований» [3]. После удаления зубы промывали в проточной воде, очищали от остатков мягких тканей, помещали в раствор 0,9% натрия хлорида и хранили не более 10 сут при температуре 5-7 ºС. Перед проведением исследований готовили продольный спил: на низкоскоростной бормашине алмазным сепарационным инструментом с водяным охлаждением срезали часть зуба, оставляя образец толщиной 1,5-2,0 мм с сохранением щечной (вестибулярной) поверхности. После этого образец промывали дистиллированной водой и сушили при температуре 90 ºС в течение 5 мин, закрепляли на стеклянной пластине. В процессе исследований мы установили отсутствие необходимости предварительной обработки изучаемой поверхности (как, например, для растровой электронной микроскопии) [1], существенно искажающей структуру исследуемого объекта. На каждом образце резца или моляра выбирали по 3 участка поверхности, расположенных на расстоянии от 2,5 до 10 мм по направлению к корню зуба. Исследование проводили с помощью сканирующего зондового микроскопа Curtus Light (Nano Scan Technology, Россия). Зондирование поверхности проводили стандартными зондами (серия NSG 15 компании NT-MDT, Россия) с резонансными частотами от 300 до 400 кГц в «полуконтактном» режиме. Зонд представляет собой массивное прямоугольное основание, на краю которого размещается балка (кантилевер). К этой балке крепится тонкая «иголка» с радиусом закругления кончика 10 нм, взаимодействие которой с исследуемой поверхностью и фиксирует микроскоп. Исследование строения спилов зубов с применением «полуконтактной» колебательной методики АСМ, по нашему мнению, позволяет наиболее точно оценить состояние поверхности. Сущность режима анализа заключалась в том, что в процессе сканирования при использовании этой методики колеблющийся кончик зонда касался поверхности и испытывал взаимодействие отталкивающих, адгезионных, капиллярных и других сил [10]. Таким образом, непосредственное механическое взаимодействие зонда с исследуемой поверхностью при этом практически отсутствует. Одновременно регистрировалось изменение не только амплитуды колебаний кантилевера, но и сдвиг фазы, обусловленный неоднородностью поверхности кристаллов гидроксиапатита. Это обстоятельство в наших исследованиях используется для получения фазового контраста. В проводимых исследованиях определяли такие параметры, как высота (Height), сигнал, пропорциональный произведению амплитуды переменного сигнала на частоте модуляции на синус сдвига фазы колебаний кантилевера относительно опорного сигнала (Mag Sin), фаза (Phase). Высота позволяет оценить трехмерную картину исследуемого объекта, выяснять наиболее характерные элементы ее структуры (рис. ). На параметры фаза и MAG Sin перепад высот в рассматриваемых образцах практически не оказывает влияние, поэтому, если, наряду с крупными, в структуре поверхности есть неоднородности в десятки раз более мелкие, их особенности удобнее исследовать именно с помощью этих параметров [2]. Порядок АСМ-сканирования: 1. Выбрать зону сканирования на поверхности образца, определив расположение и количество точек, в которых будет проводиться исследование. 2. Провести предварительное сканирование поверхности размером 100×100 мкм (с разрешением 500 на 500 точек при частоте 1 Гц). 3. В полученной таким образом 3D-картине поверхности эмали выбрать участок с наиболее характерной структурой. 4. Дальнейшие исследования выбранного участка проводить с последовательным уменьшением зоны сканирования до 50×50, 15×15 и 5×5 мкм (с разрешением 1000 на 1000 точек при частоте 1 Гц). Результаты наших исследований показали, что поверхность зубов различных групп имеет характерные элементы структуры. Поэтому в дальнейшем будут приведены результаты, типичные для определённого зуба и конкретного расстояния от жевательной поверхности до исследуемой области. В частности, на рис. представлены результаты исследования зон сканирования поверхности эмали резца и моляра. Для наглядности приведены 3D-изображения с одинаковым масштабом по высоте. Наглядность автоматически не обеспечивает единую трактовку результатов исследования. Внести элемент объективности в полученную информацию можно с использованием математической обработки полученных изображений поверхности, т. е. морфометрического анализа. С этой целью на основе функций программы Gwyddion (Czech Metrology Institute) были отобраны 2 критерия оценки рельефа поверхности. Критерий 1 - («Wa» - средняя волнистость). Основан на сравнении отдельных характерных участков сканированных поверхностей. Для этого на исследованных поверхностях, размером 50×50 мкм выделяют 3 типа характерных участков (см. рис. ). Для поверхности эмали зуба это: 1 - ровная поверхность с мелкими неоднородностями, образуемая обычными кристаллами гидроксиапатита; 2 - поверхность с преобладанием выходов «канальцев» (углубления); 3 - поверхность с преобладанием крупных кристаллов гидроксиапатита, которые имеют вид «наростов» на краях выходов «канальцев» (углублений). Последние 2 типа поверхности удобнее всего сравнивать по параметру «волнистости» - среднему размеру крупных неоднородностей и расстояния между ними, которое описывается параметром «длина волны профиля». Чем больше волнистость, тем больше высота и глубина крупных неоднородностей в исследуемом образце. На рис. приведены данные АСМ-исследования поверхности эмали моляра, полученные усреднением по 10 произвольно выбранным линиям на выделенном фрагменте 43×43 мкм при разрешении 1000×1000 и частоте 1 Гц. На этом рисунке приведены результаты сканирования (текстура) и то, как программа разделяет эти результаты на крупные (волнистость) и мелкие (шероховатость) неоднородности. Исследования показали, что для зубов одного типа средние размеры неоднородностей на разных характерных участках (выбранных по протоколу исследования) различаются незначительно (рис. ). Результаты сканирования поверхности эмали зуба получены на расстоянии 5 мм от жевательной поверхности. «Длина волны профиля» во всех случаях составляла 470 нм и отличалась от этого значения не более чем на 17%. На рис. приведены результаты сравнения количества крупных неоднородностей профиля поверхности в области одинакового размера (50×50 мкм, разрешение 1000×1000 точек) для разных типов зубов и разных расстояний (5, 10 мм) от жевательной поверхности. Результаты, полученные с использованием 1-го предложенного критерия, находятся в соответствии с субъективными оценками морфологического описания АСМ-изображений ультраструктуры, а именно: средняя высота неоднородностей эмали резцов в несколько раз меньше, чем моляров. Применение этого критерия целесообразно для морфометрического анализа крупных неоднородностей исследуемой поверхности твердых тканей зуба. 2-й критерий - основан на оценке количества точек сканированной поверхности, которые находятся на определённом расстоянии от нулевой плоскости. Программа Gwyddion позволяет сосчитать количество точек, расположенных на определённом расстоянии, усреднить данное значение и, тем самым, определить преимущественное положение точек на поверхности. В результате такой обработки основная часть неоднородностей группируются около нулевого значения. При этом положительным значениям соответствуют «наросты» кристаллов гидроксиапатита на поверхности, отрицательным - «углубления» в ткани. Для удобства восприятия полученной информации графики распределения частиц по поверхности приводятся в относительных единицах (рис. ). Обработка информации, полученной при сканировании поверхностей, позволяет наглядно определить общие черты и различия структуры поверхности исследованных образцов твердых тканей зуба. О степени «гладкости» исследованных поверхностей можно судить, введя параметр «Δh» - изменение высоты поверхности на уровне половины сечения, в которой группируются по высоте 50% точек сканированной поверхности, что позволяет оценить размер области исследования, наглядно и количественно определить общие черты и различия ультраструктуры эмали сравниваемых образцов (таблица). По данным литературы, для экспериментального АСМ-исследования поверхности эмали зуба в основном используются «контактный» или «неконтактный» способы [8, 9, 14, 17, 18]. Сочетание «полуконтактного» режима с выбором трех параметров сканирования каждой области при последовательном сокращении зоны исследования (от 100 до 5 мкм) обеспечивает получение максимально достоверных 3D-изображений ультраструктуры эмали зуба и является преимуществом настоящей методики в сравнении с другими предложенными методами АСМ-исследования. Это позволяет не использовать множество переменных и сложные математические вычисления по формулам, доступным лишь специалистам с физико-математическим образованием, а ограничиться двумя предложенными критериями для количественной оценки и объективного морфометрического анализа исследуемого образца эмали зуба. Методика анализа микроструктуры эмали зубов при помощи АСМ, включающая первичную обработку микроизображений и структурный анализ составляющих на основе сложных математических вычислений, предложена И. А. Морозовым и соавт. [9]. «Картографический подход» этих исследователей по аналогии с географическими картами близок к изложенному нами, однако, требует количественного анализа с учетом множества параметров: площади и объема всех составляющих рельефа, размера, периметра и компактности профиля поверхности и др. Для получения точных результатов требуется многократное исследование одного и того же участка поверхности эмали, нанесение на поверхность сканирования процарапанных линий (координатной сетки). Таким образом, методику сложно широко применять. Другие авторы [13, 17, 18] ограничиваются только морфологическим (описательным) анализом полученных АСМ-изображений. Некоторые исследователи используют также обработку поверхности эмали, например, протравливание 37% ортофосфорной кислотой в течение 2 с перед проведением АСМ-исследований [11]. По нашим данным, это существенно искажает результаты исследования поверхности эмали. Следовательно, для объективизации АСМ-исследований необходимо стандартизировать: подготовку спилов зуба, выбор оптимальных режимов исследования в соответствии с поставленной задачей, определить инструменты морфометрического анализа для объективизации и сопоставления полученных результатов. Итак: 1) отсутствие предварительной обработки исследуемой поверхности позволяет увидеть и определить форму, размеры, а также пространственную организацию кристаллов гидроксиапатита на наноуровне; 2) сочетание трех параметров АСМ-сканирования в «полуконтактном» режиме и последовательного уменьшения исследуемой области от 100 до 5 мкм позволяет получать максимально подробные изображения участка поверхности эмали зуба и характерных элементов его ультраструктуры; 3) апробация методики на исследованных образцах даёт возможность утверждать, что предложенная методика проста в использовании, при этом не уступает по объективности более сложным методам морфометрии поверхности эмали зуба.

About the authors

V. D. Goncharov

First I. P. Pavlov St. Petersburg State Medical University

Email: vdqoncharov@rambler.ru

I. N. Antonova

First I. P. Pavlov St. Petersburg State Medical University

A. V. Kipchuk

First I. P. Pavlov St. Petersburg State Medical University

Email: dentist-alena@yandex.ru

A. I. Skorobogatova

V. I. Ulyanov-Lenin State University of Electrical Engineering

References

Supplementary files