POSTNATAL MORPHOGENESIS OF PURKINJE CELLS IN RAT CEREBELLUM

Full Text

Формирование дефинитивной структуры коры мозжечка у крысы происходит в течение длительного периода постнатального онтогенеза [7]. Этот процесс связан с дифференцировкой нейронов, образованием нейронных связей и их функциональной специализацией [6]. Клетки Пуркинье (КП) мозжечка принимают поступающую в кору информацию и по своим аксонам осуществляют её выход. В связи с этим сведения о количестве, структурной и ультраструктурной организации этих нейронов являются необходимыми для понимания морфогенеза мозжечка [8]. У крысы предшественники КП формируются на 13-16-е сутки эмбриогенеза в вентрикулярном слое крыши IV желудочка, а затем мигрируют в радиальном направлении, образуют многорядный слой и только к 3-4-м суткам постнатального развития слой КП становится однорядным. Выравнивание КП в монослой обеспечивается механическими факторами: давлением утолщающегося зернистого слоя и барьером, образованным параллельными волокнами, препятствующими смещению перикарионов КП в молекулярный слой. Затем до 12-суточного возраста расстояние между перикарионами КП быстро увеличивается, что связано с формированием вокруг них нейропиля. Увеличение размеров самих перикарионов и рост дендритов продолжаются до 30-х суток, при этом сопровождаются ультраструктурными изменениями в этих нейронах [5]. У новорожденных крысят в цитоплазме КП содержатся большое количество свободных рибосом, формирующийся комплекс Гольджи, к 10-м суткам - большое количество митохондрий, гладкая эндоплазматическая сеть, тело КП окружено глией [4], ак 15-суточному возрасту увеличивается количество рибосом, связанных с мембранами [5]. На светооптическом уровне описана постнатальная дифференцировка КП, характеризующаяся увеличением размеров их перикарионов, уменьшением количества на единице длины извилины, изменением соотношения данных клеток по хроматофилии цитоплазмы [2]. Количественная оценка развития органелл КП - филогенетически древней коры мозжечка крысы в динамике постнатального онтогенеза в литературе отсутствует. Цель настоящего исследования - качественная и количественная оценка динамики постнатального органеллогенеза в развивающихся КП мозжечка крысы. Материал и методы. Эксперименты выполнены на самках беспородных белых крыс с исходной массой 180±20 г и родившемся от них потомстве - 36 крысят (электронно-микроскопическое исследование - 12 крысят, гистохимическое - 24). Исследование проведено с учетом «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных», а также получено разрешение комитета по биомедицинской этике Гродненского государственного медицинского университета (протокол № 7 от 23.12.2013 г.). Животные находились на стандартном рационе вивария. От каждой самки брали по одному крысенку по достижении ими 2-, 7-, 15-хи 45-х суток после рождения и декапитировали. Для изучения особенностей метаболизма КП образцы мозжечка замораживали в жидком азоте. В криостате Leica CM 1850 (Leica Microsystems GmbH, Германия) при температуре -14 ºС готовили сагиттальные криостатные срезы, которые обрабатывали для выявления активности сукцинатдеги-дрогеназы (СДГ, сукцинат: акцептор - оксидоредуктаза). Расположение филогенетически древнего отдела коры мозжечка в гистологических препаратах развивающегося мозжечка крысят определяли по С. Н. Оленеву [3] и G. Paxinos иС.Watson [11]. Изучение гистологических препаратов, их микрофотографирование и морфометрическое исследование проводили с помощью микроскопа Axioscop 2 plus (Zeiss, Германия), цифровой видеокамеры (LeicaDFC 320, Германия) и программы анализа изображения ImageWarp (Bitflow, США). Количественную оценку активности СДГ осуществляли, определяя оптическую плотность полученного осадка хромогена в цитоплазме нейронов на максимуме поглощения окрашенных продуктов реакций. Относительную активность фермента выражали в единицах оптической плотности. Для электронно-микроскопического исследования кусочки мозжечка помещали в 1% осмиевый фиксатор на буфере Миллонига (рН 7,4) на 2 ч при температуре 4 ºС [10]. Далее их промывали в смеси буфера Миллонига (20 мл) и сахарозы (900 мг), обезвоживали в этаноле восходящей концентрации, ацетоне, проводили через смеси смол (Araldite М+Araldite М hardener 964+дибутилфталат+Araldite М accelerator 960) (Sigma-Aldrich) и ацетона, заключали в заливочную смолу. Затем изготавливали ультратонкие срезы толщиной около 35 нм на ультрамикротоме EM UC 7 (Leica , Германия), собирали на опорные медные сеточки (Sigma, размер ячейки 300x83), контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца [12]. Полученные препараты изучали в электронном микроскопе JEM-1011 (JEOL, Япония), фотографировали цифровой камерой Olympus MegaView III (Olympus Soft Imaging Solutions, Германия). Морфометрию ультраструктур проводили с помощью программы для обработки изображения iTEM (JEOL, Япония). Измеряли площадь перикариона КП, ядра, ядрышка, подсчитывали ядерно-цитоплазматическое отношение, оценивали количество лизосом, индивидуальную, относительную площадь в цитоплазме, форму митохондрий, количество и длину крист на 1 мкм2 митохондрий, а также ширину цистерн комплекса Гольджи (КГ), длину цистерн гранулярной эндоплазматической сети (ГЭС), количество связанных рибосом на 1 мкм длины цистерны ГЭС. Полученные средние значения от животных каждой экспериментальной группы анализировали методами непараметрической статистики с помощью программы Statistica 6.0 для Windows (Stat. Soft, Inc., США). В описательной статистике для каждого показателя определяли значения медианы (Ме) и интерквартильного диапазона (IQR). Результаты исследования. У крыс в постнатальном периоде онтогенеза (со 2-х по 15-е сутки) по мере дифференцировки происходит прогрессивное увеличение размеров перикарионов и ядер КП. К 45-м суткам размеры перикарионов уже не возрастают, а ядер - даже уменьшаются. При этом происходит 3-кратное уменьшение ядерно-цитоплазматического отношения. Ядрышки КП со 2-х по 45-е сутки увеличиваются в размерах. На 45-е сутки после рождения их площадь в 4 раза больше, чем на 2-е сутки (табл. 1). У 2-суточных крысят КП располагаются в несколько рядов, все нормохромные. В КП ядра овальные, ядерная оболочка образует неглубокие инвагинации, перинуклеарное пространство узкое. В ядре равномерно расположен эухроматин, который слегка конденсирован у ядерной оболочки. В центре ядра или несколько эксцентрично расположено ядрышко, состоящее из фибриллярного и гранулярного компонентов. В апикальной части КП сконцентрирована большая часть цитоплазмы, где равномерно расположены митохондрии, имеющие преимущественно округлую форму (рисунок, а). Некоторые митохондрии имеют электронноплотный матрикс. Цистерны ГЭС короткие (см. рисунок, д), расположены рядом с митохондриями. КГ еще полностью не сформирован, чаще представлен группой плотно расположенных вакуолей, реже состоит из нескольких коротких цистерн, параллельных друг другу (см. рисунок, и). Формирующаяся ГЭС представлена короткими канальцами. В базальной части перикарионов расположены только свободные рибосомы. На 2-е сутки постнатального периода онтогенеза количество митохондрий на единице площади цитоплазмы наибольшее, а по мере роста перикариона к 45-м суткам - снижается в 2 раза, но прогрессивно увеличиваются (2-45-е сутки) их размеры. При этом площадь, занимаемая митохондриями в цитоплазме КП, варьирует в разные сроки от 6 до 10% (табл. 2). Округлая форма этих органелл характерна для раннего периода постнатального онтогенеза (2-15-е сутки), затем она меняется на более удлиненную (45-е сутки) (см. табл. 2). Со 2-х по 45-е сутки относительное количество крист на 1 мкм2 площади митохондрии почти не изменяется, но при этом к 45-м суткам в 1,5 раза увеличивается их длина (см. табл. 2). Соответственно в цитоплазме КП мозжечка крыс в постнатальном онтогенезе прогрессивно повышается активность фермента митохондрий СДГ (2-е сутки - 0,10±0,02; 7-е сутки - 0,21±0,03; 15-е сутки - 0,22±0,02; 45-е сутки - 0,21±0,02 ед. опт. пл.). Со 2-х по 45-е сутки прогрессивно увеличивается средняя длина цистерн ГЭС, количество рибосом, связанных с мембранами на 1 мкм длины цистерны ГЭС, почти не изменяется (см. табл. 2), но при этом в цитоплазме располагается большое количество свободных рибосом. На 2-еи 7-е сутки в КП мозжечка КГ представлен скоплениями вакуолей и короткими узкими цистернами, на 15-еи 45-е сутки - параллельно расположенными более протяженными цистернами, количество которых возрастает. Ширина цистерн КГ со 2-х по 45-е сутки постепенно возрастает (см. рисунок, и-м; табл. 2). На 2-15-е сутки постнатального развития количество лизосом на единице площади цитоплазмы и их удельная площадь в цитоплазме остаются крайне небольшими, ак 45-м суткам резко возрастают. Небольшое увеличение площади лизосом в КП наблюдается у 7-суточных крысят по сравнению с таковым у 2-суточных, к 15-м суткам их площадь становится меньше, а затем возрастает к 45-м суткам почти в 2 раза, чем в 15 сут (см. табл. 2). Обсуждение полученных данных. Таким образом, постнатальная дифференцировка КП сопровождается изменениями ультраструктуры. По мере созревания нейронов площадь их перикарионов увеличивается в большей степени, чем площадь ядра, что приводит к прогрессивному уменьшению ядерно-цитоплазматического отношения. Незрелая КП характеризуется малым количеством цитоплазмы, в которой не сформирована эндоплазматическая сеть, а свободные рибосомы значительно преобладают над связанными, митохондрии округлой формы, имеют небольшие размеры. На начальном этапе развития КП преобладание свободных рибосом обусловлено биосинтезом белков, определяющих морфогенетические процессы, лежащие в основе дифференцировки клеток. Длительное сохранение большого количества свободных рибосом в КП связано с продолжительным периодом роста дендритов этих клеток [1]. Основной показатель созревания нейронов - увеличение количества рибосом на мембранах и формирование ГЭС связано с биосинтезом белков, осуществляющих синаптическую передачу. Со 2-х по 45-е сутки происходит уменьшение плотности расположения митохондрий в цитоплазме, что обусловлено значительным (в 4 раза) увеличением площади перикарионов. При этом площадь, занимаемая этими органеллами в цитоплазме, изменяется мало, что связано с увеличением их размеров. Наблюдается также возрастание количества и длины крист, сопровождающееся повышением в цитоплазме активности СДГ (фермент цикла Кребса), что является необходимым для энергетического обеспечения функций зрелых КП. Уменьшение фактора формы и увеличение фактора элонгации митохондрий обусловлено изменением их округлой формы на более удлиненную. К 45-м суткам в 3 раза (по сравнению с 2-суточными крысами) возрастает количество лизосом на 1 мкм2 цитоплазмы, что свидетельствует о формировании внутриклеточного аппарата переваривания и защиты, необходимого для удаления (путем аутофагии) поврежденных мембран и органелл. В постнатальном онтогенезе процесс дифференцировки КП сопровождается формированием КГ, ростом, упорядоченным расположением и расширением его цистерн. Полученные количественные данные согласуются и дополняют уже имеющиеся сведения о созревании КП мозжечка крысы в постнатальном онтогенезе [4, 9]. Наиболее информативными морфометрическими показателями зрелости КП были: уменьшение ядерноцитоплазматического отношения, увеличение площади ядрышка, возрастание размеров и удлинение митохондрий, увеличение количества связанных с мембранами рибосом и длины канальцев ГЭС, увеличение количества, размеров лизосом и относительной площади, занимаемой ими в цитоплазме. Таким образом, применение морфометрии ультраструктур для описания динамики постнатального органеллогенеза КП мозжечка позволяет объективно оценить процесс постнатальной дифференцировки КП мозжечка крысы, сопровождающийся усложнением синтетического, энергетического аппарата и аппарата внутриклеточного переваривания и защиты. Данный способ является эффективным и может быть использован также при изучении влияния на постнатальный морфогенез мозжечка различных экспериментальных воздействий и патологических состояний.

About the authors

S. M. Zimatkin

Grodno State Medical University

Email: smzimatkin@mail.ru
Department of Histology, Cytology and Embryology

O. A. Karniushko

Grodno State Medical University

Email: karnyushko-olga@mail.ru
Department of Histology, Cytology and Embryology

O. B. Ostrovskaya

Grodno State Medical University

Email: Astrowskaja@gmail.com
Department of Histology, Cytology and Embryology

References

Supplementary files