THE CHANGES IN THE LUNG STRUCTURE AND MATRIX METALLOPROTEINASE 9 EXPRESSION IN RATS UNDER THE INFLUENCE OF OXYTOCIN IN THE COMBINED STRESS

Full Text

Легкие как орган, имеющий контакт с внешней средой, находятся одновременно под воздействием стрессорных факторов бактериальной и небактериальной природы. Одним из звеньев, участвующих в поддержании гомеостаза легких, являются матриксные металлопротеиназы. Матриксная металлопротеиназа-9 (ММП-9) участвует в обеспечении иммунной защиты легких, элиминации антигенов и детрита, ремоделировании легких [7, 8]. Однако гиперэкспрессия ММП-9 может быть причиной повреждения тканей легких [6], что требует более подробного изучения факторов, ведущих к экспрессии и ингибированию этой протеиназы. Механизмы защиты в органах во многом определяются функционированием гипоталамогипофизарно-надпочечниковой системы и сопровождаются изменением уровня концентрации окситоцина (ОТ) в гипоталамусе и крови, что позволяет предположить участие ОТ в регуляции защитных реакций в организме и поддержания гомеостаза в легких. Исследования, посвященные изучению влияния ОТ на защитные механизмы в легких, отсутствуют [1]. Цель настоящего исследования - определение изменений в респираторных отделах легких у крыс и экспрессии ММП-9 при интратрахеальном введении кишечной палочки на фоне длительного эмоционально-болевого стресса (ЭБС) и влияния окситоцина на выявленные изменения. Материал и методы. Работа выполнена на 30 белых беспородных крысах-самцах массой 250-270 г. Эксперименты с животными проводили в соответствии с «Правилами по обращению, содержанию, обезболиванию и умерщвлению экспериментальных животных» (МЗ СССР, 1877 г.; МЗ РСФСР, 1977 г.) Крысы были разделены на 3 группы. 1-ю группу составили контрольные крысы (n=10), которым интратрахеально вводили взвесь суточной агаровой культуры штамма кишечной палочки (E. coli А37) в дозе 200 млн микробных тел в 0,2 мл изотонического раствора хлорида натрия. Во 2-ю группу вошли крысы (n=10), у которых вызывали ЭБС ежедневно по 3 ч в течение 7 сут и на 8-е сутки вводили взвесь суточной агаровой культуры кишечной палочки в той же дозе. Моделирование ЭБС проводили на крысах по методике O. Desiderato и соавт. [5]. В специальной камере животных подвергали воздействию тока, избежать которого животные могли путем ухода на платформу, расположенную в центре камеры. Это приводило к выработке условного рефлекса избегания, проявляющегося постоянным нахождением крыс на платформе. Последующее нанесение ударов током через пол платформы сопровождалось формированием стрессовой реакции у животных, обусловленной как наличием конфликта между выработанным условным рефлексом избегания и безусловным болевым раздражителем, так и постоянным напряженным ожиданием электроболевого раздражения. У животных 3-й группы (n=10) однотипно как у крыс 2-й группы вызывали стресс и вводили внутримышечно по 0,02 ЕД ОТ (Gedeon Richter, Германия). После введения на 8-е сутки взвеси штамма культуры E. coli А37 продолжали ежедневно вводить внутримышечно ОТ до окончания эксперимента. Животных, находящихся под эфирным наркозом декапитировали через 1 и 4 сут после контаминации бактериями. Объектом исследования служили респираторные отделы сердечной доли правого легкого. Материал для световой микроскопии фиксировали в 10% нейтральном формалине, обрабатывали по стандартной методике, заливали в парафин и срезы окрашивали гематоксилином - эозином. Для получения полутонких и ультратонких срезов кусочки легких размером 2×2 мм3 фиксировали в 2,5% растворе глутаральдегида на 0,1М фосфатном буфере и 1% растворе четырехокиси осмия, обезвоживали по стандартной методике и заливали в смесь эпона и аралдита. Готовили полутонкие срезы на ультратоме LKB-5 (Швеция), окрашивали метиленовым синим и основным фуксином и подвергали морфометрическому анализу. Ультратонкие срезы последовательно контрастировали спиртовым раствором уранилацетата и цитратом свинца. Исследование ультратонких срезов проводили на электронном микроскопе ЭМВ 100АК при увеличении от 4000 до 40 000. Для иммуноцитохимических исследований использовали парафиновые срезы толщиной 5-6 мкм, помещенные на стекла Super frost plus. Определение матриксной металлопротеиназы-9 (ММП-9) осуществляли поликлональными кроличьими антителами (BioGenex, США) в разведении 1:50 с применением стрептавидин-биотин-пероксидазного комплекса с 3,3-диаминобензидин-тетрагидрохлоридом (DAB) в качестве хромогена той же фирмы. Апоптоз клеток идентифицировали по фрагментации ДНК с использованием набора Apoptag (Plus Peroxidase in situ Apoptosis Detection Kit-S 71010) согласно протоколу фирмы-производителя (Intergen, США). В препаратах при 1000-кратном увеличении микроскопа определяли индекс ММП-9-иммунопозитивных клеток (нейтрофилов, макрофагов, альвеолоцитов II типа) и индекс апоптоза альвеолоцитов II типа, как долю положительно окрашенных клеток от общего числа подсчитанных клеток в 10 случайно выбранных полях зрения. Морфометрические исследования на светооптическом уровне были осуществлены с использованием цифровой фотонасадки ScopeTek 500 DMC и программ Minisee и ScopePhoto. Оценку статистической значимости полученных данных проводили по t-критерию Стьюдента с использованием программы Microsoft Excel 5.0a. Различия величин считались значимыми при P ≤ 0,05 (95%). Результаты исследования. В 1-й (контрольной) группе животных во все сроки наблюдения выявлялись морфологические изменения в респираторных отделах легких. В стенках альвеол, легочных сосудов и интерстиции наблюдалась лейкоцитарная инфильтрация с преобладанием нейтрофилов и макрофагов (таблица). Бактерии свободно располагались в альвеолярных пространствах и непосредственно на поверхности альвеолоцитов. В основном преобладал трансцеллюлярный путь миграции бактерий через структуры аэрогематического барьера. В альвеолоцитах II типа наиболее характерными изменениями были увеличение в объеме и вакуолизация цитоплазмы. Среди альвеолоцитов II типа имелись Apoptagпозитивные клетки (рис. 1, а). В респираторных отделах легких выявлялась экспрессия ММП-9 в цитоплазме нейтрофилов и макрофагов, альвеолоцитов, эндотелиоцитов сосудов, в клетках интерстиция и межклеточном веществе. Альвеолоциты II типа, особенно увеличенные в объеме, экспрессировали ММП-9 и имели наиболее интенсивную реакцию через 1 сут после введения антигена (см. рис. 1, б). У животных 2-й группы на световом и электронно-микроскопическом уровнях было выявлено, что альтеративные изменения в легких проявляются в большей степени. Лейкоцитарные инфильтраты располагались вокруг бронхиол, легочных сосудов, просвете альвеол и интерстиции. На поверхности стенок альвеол встречались реактивно измененные макрофаги (рис. 2). Количество нейтрофилов в просвете альвеол и интерстиции респираторных отделов легких по сравнению с таковым в контроле было увеличено через 1 сут после введения антигена ик 4-м суткам снижалось. Количество макрофагов в респираторных отделах было больше по сравнению с контрольными показателями (см. таблицу). Альвеолоциты часто утрачивали контакты с базальной пластинкой. В межальвеолярных перегородках располагались фрагменты лизированных и гомогенизированных коллагеновых волокон. Средиальвеолоцитов II типавстречалиськлетки, имеющие набухшие митохондрии с частичной или полной утратой крист. В пластинчатых тельцах количество осмиофильного материала уменьшалось, ламеллы подвергались гомогенизации или лизировались, и на их местах образовывались оптически пустые пространства (рис. 3). Часть альвеолоцитов II типа имели электронно-плотную цитоплазму, уменьшенные в размере гомогенные ядра в состоянии пикноза. Выявлялись альвеолоциты с положительной Apoptag-реакцией (рис. 4), количество которых превосходило контрольные показатели (см. рис. 1, а). Иммуноцитохимическое исследование выявило увеличение количества клеток, экспрессирующих ММП-9 среди альвеолоцитов и лейкоцитов (рис. 5). Число альвеолоцитов II типа, экспрессирующих ММП-9, превосходило контрольные показатели (см. рис. 1, б). Число нейтрофилов с положительной реакцией на ММП-9 в альвеолах было больше, чем у животных контрольной группы через 1 сут и практически не отличалось на 4-е сутки опыта. Количество ММП-9-позитивных макрофагов по сравнению с таковым в контроле в альвеолах было больше в 1-е сутки наблюдения и уменьшалось к 4-м суткам (см. таблицу). Эндотелиоциты легочных сосудов во все сроки наблюдения были ММП-9-иммунопозитивными. В сосудах лейкоциты, экспрессирующие ММП-9, контактировали с обнаженной базальной мембраной. Они мигрировали за ее пределы и периваскулярно формировали крупные инфильтраты. У животных подопытной группы при введении ОТ в респираторных отделах легких при наличии признаков альтерации, отека и лейкоцитарной инфильтрации не наблюдалось деструктивных изменений. Электронно-микроскопическая организация альвеолоцитов II типа свидетельствовала об активизации внутриклеточного метаболизма, проявляющейся гиперплазией мембран гранулярной эндоплазматической сети, увеличением количества, объемной плотности осмиофильных пластинчатых телец и митохондрий. Количество альвеолоцитов II типа, экспрессирующих ММП-9 (см. рис. 5), было меньше, чем в группах сравнения (см. рис. 1, б). Число погибающих альвеолоцитов, что подтверждалось их электронно-микроскопическими признаками, и количество Apoptag-позитивных клеток уменьшалось по сравнению с таковым в контрольной и 2-й подопытной группой (см. рис. 1, а). При введении ОТ лейкоцитарная инфильтрация была выражена в меньшей степени, чем у животных, его не получавших. Количество нейтрофилов в альвеолах легких было меньше, чем у контрольных животных и животных, не получавших ОТ. Число макрофагов в альвеолах во все сроки наблюдения было больше, чем в контроле, но меньше у животных, не получавших ОТ (см. табл. 1). У крыс 3-й подопытной группы в легких количество клеток, экспрессирующих ММП-9, было незначительным. Экспрессия ММП-9 была характерна для нейтрофилов и макрофагов. Количество нейтрофилов, экспрессирующих ММП-9, по сравнению с таковым во 2-й группе было меньше во все сроки наблюдения, а макрофагов меньше на 4-е сутки по сравнению с контролем (см. таблицу). Мигрирующие нейтрофилы и макрофаги формировали инфильтраты периваскулярно, где содержание ММП-9-позитивных нейтрофилов было меньше, чем во 2-й подопытной группе. Обсуждение полученных данных. Результаты световой микроскопии выявили у животных 2-й подопытной группы значительную инфильтрацию нейтрофилами и макрофагами респираторных отделов легких. Реакция нейтрофилов и макрофагов является важным признаком синдрома острого повреждения легких при воздействии кишечной палочки и её эндотоксинов [3]. Результаты настоящего исследования показали высокий уровень экспрессии ММП-9 в лейкоцитах, резидентных клетках легких и межклеточном веществе. Увеличение количества клеток, экспрессирующих ММП-9, совпадало с повышенной степенью лейкоцитарной инфильтрации в легких. Существует предположение, что ММП-9 является основным фактором, обеспечивающим лейкоцитам возможность прохода через базальные мембраны [4]. У животных 2-й подопытной группы деструктивные изменения клеток-резидентов и интерстиция легких наблюдались на фоне увеличения количества клеток, экспрессирующих ММП-9, и степень деструктивных изменений находилась в прямой зависимости от увеличения их количества. Вместе с тем ММП-9, обеспечивая миграцию лейкоцитов при инфицировании или повреждении легких, при неконтролируемом увеличении ее количества и активности разрушает клетки-резиденты, межклеточное вещество и таким образом стимулирует воспаление [11]. Полученные результаты об уменьшении инфильтрации легких нейтрофилами и макрофагами при введении ОТ согласуются с данными ряда исследований, посвященных изучению действия ОТ в условиях воспаления в органах других систем организма. Применение ОТ при экспериментальном воспалении органов пищеварительного тракта оказывало эффективное противовоспалительное и противоотечное действие, которое сопровождалось уменьшением проницаемости сосудов и миграции лейкоцитов с уменьшением лейкоцитарной инфильтрации в очагах воспаления [2]. Данные иммуноцитохимического исследования у крыс 3-й подопытной группы выявили уменьшение экспрессии ММП-9 в лейкоцитах, резидентных клетках и межклеточном веществе, что соответствовало низкому уровню лейкоцитарной инфильтрации и уменьшению признаков альтерации структур респираторных отделов и легочных сосудов. Эти данные позволяют предположить, что миграция активированных лейкоцитов из сосудов снижалась в связи с уменьшением экспрессии ММП-9. Возможно, подавление ОТ миграции лейкоцитов из сосудов связано с его участием в регуляции экспрессии ММП 9. Сведений об участии ОТ в регуляции экспрессии ММП-9 в легких нет. При изучении патологии легких на различных моделях воспаления получены факты о прямой зависимости между увеличением уровня провоспалительных цитокинов и увеличением экспрессии и секреции ММП-9 клетками легких [9]. Известно, что под действием ОТ синтез провоспалительных цитокинов и хемокинов в макрофагах, нейтрофилах и эндотелиоцитах снижается [10], что является фактором уменьшения экспрессии ММП-9. Таким образом, полученные данные позволили сделать вывод о патогенетической роли ММП-9 при инфицировании на фоне комбинированного стресса. Деструкция клеток и межклеточного вещества легкого являются результатом воздействия ММП-9 на структуры легкого путем разрушения базальных мембран сосудов и альвеол, эпителия легких, деградации коллагеновых волокон, увеличения проницаемости стенки сосудов и активизации миграции лейкоцитов в интерстиций респираторных отделов и стенок сосудов, вызывая задержку восстановления структур легкого. Применение ОТ уменьшило негативное действие стрессорных факторов на структуры легких, что было связано со снижением лейкоцитарной инфильтрации, уменьшением экспрессии и повреждающего действия ММП-9 и способствовало сохранению и активизации протекторных свойств лейкоцитов и клеток-резидентов легких.

About the authors

A. N. Kozlova

Orenburg State Medical University

Email: gistolog31@mail.ru
Department of Histology, Cytology, and Embryology

References

Supplementary files