AGE-RELATED CHANGES OF NO-CONTAINING SYMPATHETIC NEURONS IN RAT SPINAL CORD

Full Text

Симпатические преганглионарные нейроны располагаются в спинном мозгу не только в боковом роге, где располагается главная часть промежуточно-латерального ядра (nucleus intermediolateralis, pars principalis - nucl. ILp) и канатиковая часть этого ядра (nucleus intermediolateralis, pars funicularis - nucl. ILf), но и в дорсально расположенном межостистом спинномозговом ядре (nucleus intercalatus spinalis - nucl. IC), включая его параэпендимальную часть (nucleus intercalatus spinalis, pars paraependymalis - nucl. ICpe) [5]. Нейроны этих ядер являются холинергическими и содержат ацетилхолин, который синтезируется под влиянием холинацетилтрансферазы (ХАТ) - фермента синтеза ацетилхолина. В холинергических нейронах, наряду с ХАТ, выявляется NO-синтаза (NOS) - фермент синтеза оксида азота [14]. Оксид азота (NO) играет роль универсального модулятора разнообразных функций организма, включая регуляцию дыхания, кровообращения, поддержание иммунного статуса организма, пластичности нервной ткани, памяти, высвобождения нейротрансмиттеров [3, 4, 12]. NO является внутри- и межклеточным посредником, выполняющим различные сигнальные функции. В синапсах NO может действовать на пре- и постсинаптическом уровне [3, 8, 12]. В ходе постнатального онтогенеза происходит изменение нейротрансмиттерного состава нейронов автономной нервной системы, в частности симпатических узлов [2]. Современные литературные данные свидетельствуют о возможности солокализации NOS и ХАТ в отдельных нейронах спинного мозга с момента рождения [1]. Однако имеется мало данных относительно возрастных изменений нейрохимического состава преганглионарных симпатических нейронов. Поэтому целью настоящей работы было определение локализации, процентного состава и морфологических характеристик преганглионарных симпатических NOS-иммунореактивных нейронов спинного мозга в постнатальном онтогенезе. Материал и методы. Исследование проведено на 35 белых крысах-самках линии Вистар в возрасте 3, 10, 20, 30, 60 сут, 6 мес и 3 лет после рождения. Содержание, эксперименты и выведение животных из них проводили с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». На данное исследование получено разрешение этического комитета (№ 11 от 29.09.2016 г.). Эвтаназию животных осуществляли под уретановым наркозом (3 г/кг, внутрибрюшинно), далее проводили транскардиальную перфузию изотоническим раствором хлорида натрия с гепарином (5 ЕД/л), затем 4% раствором параформальдегида на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4). Для исследования производился забор TII-сегментов грудного отдела спинного мозга. Выделенный материал фиксировали в течение 2 ч в предыдущей смеси, после чего промывали трехкратно в 0,01 M фосфатно-солевом буфере (PBS), pH 7,4 (ООО «Биолот», Санкт-Петербург, Россия) в течение 30 мин и оставляли в 30% растворе сахарозы на 24 ч. Из фиксированного материала на криостате готовили серии срезов толщиной 14 мкм. С целью выявления нейронов, иммунореактивных к NOS, применяли мечение поликлональными антителами кролика к нейрональной изоформе NOS фирмы LifeSpan Biosciences (США), марка антитела LS-B8696, при разведении 1:300 и к ХАТ - антителами козы фирмы Millipore (США) в разведении 1:50. Срезы преинкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в PBS с добавлением 10% ослиной сыворотки (Jackson Immunoresearch, США), 1% тритон X-100 (Sigma-Aldrich, США), 0,1% бычьего сывороточного альбумина (ООО «Биолот», Санкт-Петербург, Россия), 0,05% тимерозола. Затем срезы инкубировали с первичными антителами в течение 24 ч при комнатной температуре. После кратковременной промывки в PBS срезы инкубировали с вторичными ослиными антикроличьими и антикозьими антителами, конъюгированными с флюорохромом FITС или Cy3 (Jackson Immunoresearch, США) в течение 2 ч (разведение 1:150), дающими зеленую или красную флюоресценцию. После этого срезы отмывали в PBS и заключали в среду для иммунофлюоресценции (VectaShield, Vector Laboratories, США). Анализ препаратов, подвергнутых процедуре иммуногистохимической обработки, проводился с использованием программно-аппаратного комплекса, включающего флюоресцентный микроскоп Olympus BX45 (Япония) с набором фильтров (модуль зеркал U-FBWA - синее возбуждение, фильтр возбуждения BP460-495, барьерный фильтр BA510550; модуль зеркал U-FGWА - зеленое возбуждение, фильтр возбуждения BP530-550, барьерный фильтр BA575625), охлаждаемую ССD камеру Tucsen TCH-5.0ICE (Xintu Photonics, Китай) и компьютер на базе процессора Intel Core i7. Получение и последующая обработка изображений проводились с использованием программы ISCapture, версия 3.6 (Xintu Photonics, Китай). Морфологические свойства нейронов (коэффициент округлости, площадь сечения, максимальный диаметр) определялись при помощи программы ImageJ (NIH, США). Оценивали площадь нервных клеток и процент иммунореактивных нейронов. Анализу подлежали нервные клетки, срез которых прошел через ядро. Определяли процент NOS-иммунопозитивных/ХАТиммунонегативных, NOS-иммунопозитивных/ХАТ-иммунопозитивных, NOS-иммунонегативных /ХАТ-иммунопозитивных нейронов. Для этого определяли отношение каждой из вышеперечисленных групп клеток к общему числу (NOS и ХАТ) иммунопозитивных нейронов, которое принимали за 100%. Для определения площади сечения нейронов в случайном порядке брали 100 нейронов, иммунопозитивных к NOS в каждой возрастной группе. Статистический анализ включал определение средней арифметической и ее стандартной ошибки. Значения сравнивали при помощи t-критерия Стьюдента, ANOVA, Манна- Уитни U-теста. Значения считались достоверными при значении p<0,05. Результаты исследования. В спинном мозгу NOS выявлялась в автономных симпатических ядрах: nucl. ILp, nucl. ILf, nucl. IC и nucl. ICpe с момента рождения у всех животных (рис. 1). Обнаруживали отдельные NOSпозитивные клетки также в области дорсального рога, промежуточного серого вещества и вентральной части области вокруг центрального канала, которые, по литературным данным, не относятся к автономной нервной системе [11]. Большинство NOS-содержащих нейронов на срезах имели круглую или веретеновидную форму. Также отмечались отдельные клетки треугольной формы. У крыс всех возрастов наибольшее количество NOS-позитивных симпатических преганглионарных нейронов выявлялось в nucl. ILp (табл. 1, см. рис. 1). В первые 2 мес жизни относительное содержание NOS-позитивных нейронов в nucl. ILf, nucl. IC и nucl. ICpe достоверно увеличивалось, ав nucl. ILp - снижалось. Средняя площадь профильного поля NOS-иммунореактивных преганглионарных нейронов увеличивалась в онтогенезе с момента рождения до 10-х суток жизни с 176±8 до 208±14 мкм2 и далее достоверно не изменялась. У новорожденных и 10-суточных крыс большинство нейронов в nucl. ILp были NOSпозитивными и одновременно содержали фермент холинацетилтрансферазу (рис. 2, табл. 2). Однако в этих возрастных группах обнаруживалась также популяция NOS-позитивных/ХАТнегативных нейронов (26% - у новорожденных и 8% - у 10-суточных), которые не наблюдались у более взрослых животных. В течение первых 20 сут доля NOS-иммунопозитивных нейронов в nucl. ILp существенно уменьшалась, а ХАТ-положительных, наоборот, увеличивалась. У 30-суточных крысят около 45% преганглионарных симпатических спинномозговых нейронов были NOS-иммунонегативными. Эта доля оставалась впоследствии почти неизменной. В nucl. ILf у всех животных NOS-позитивные нейроны были ХАТ-позитивными. В nucl. IC и nucl. ICpe содержание NOS-позитивных/ХАТнегативных, NOS-позитивных/ХАТ-позитивных, NOS-негативных /ХАТ-позитивных достоверно не отличалось между собой у животных всех возрастных групп. Таким образом, в раннем постнатальном онтогенезе наблюдается возрастное изменение NO-ергической симпатической передачи, проявляющееся в снижении числа симпатических преганглионарных нейронов, экспрессирующих NOS. Обсуждение полученных данных. В результате проведенного исследования установлено,что подавляющее большинство симпатических преганглионарных нейронов у крыс от момента рождения до старости содержат NOS, которая при этом солокализована с ферментом синтеза ацетилхолина - холинацетилтрансферазой, что подтверждается литературными данными [14]. Однако у крыс до 10-х суток жизни в nucl. ILp обнаруживалась группа NOS-позитивных/ХАТнегативных нейронов, которые не наблюдались у более взрослых животных. В течение первых 20 сут доля NOS-иммунопозитивных нейронов вышеупомянутой области существенно уменьшается, а ХАТ-положительных, наоборот, увеличивается. Преганглионарные симпатические волокна образуют синапсы с нейронами пара-и превертебральных узлов, которые у грызунов являются NOS-негативными [6, 9]. Ранее было показано, что в метасимпатических интрамуральных узлах кишки у мыши и человека NOS-иммунореактивные нейроны в эмбриогенезе созревают раньше, чем холинергические [7, 13]. В позднем эмбриональном и раннем постнатальном периоде NOS экспрессируется большим числом нейронов по сравнению с более взрослыми особями [7]. Установлено, что NO может модулировать синаптическую функцию в различных регионах мозга. Так, в базальных ганглиях NO почти в 2 раза увеличивает секрецию ацетилхолина [12]. NO также играет важную роль в нейропластичности, способствуя развитию дендритов и формированию синапсов [4, 8]. Известно, что синаптическая передача в симпатических узлах у крыс окончательно формируется к 20-м суткам жизни [10], поэтому, вероятно, NO может служить трофическим фактором, способствующим созреванию синапсов в раннем постнатальном онтогенезе. Заключение. В раннем постнатальном онтогенезе в преганглионарных симпатических нейронах происходит снижение экспрессии нейрональной NOS и увеличение числа нейронов, содержащих ХАТ. Таким образом, можно предположить, что NO способствует улучшению синаптической передачи в автономных узлах в пренатальном и раннем постнатальном периоде, которая еще на этот момент остается незрелой. Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 16-04-00538). Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: П. М. М. Сбор и обработка материала: К. Ю. М. Статистическая обработка данных: К. Ю. М. Анализ и интерпретация данных: П. М. М. Написание текста: П. М. М. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

About the authors

K. Yu. Moiseyev

Yaroslavl State Medical University

Department of Normal Physiology with Biophysics

P. M. Masliukov

Yaroslavl State Medical University

Email: mpm@ysmu.ru
Department of Normal Physiology with Biophysics

References

Supplementary files