DYNAMICS OF STRUCTURAL CHANGES AND CD68 AND KI-67 MARKER EXPRESSION IN RAT THYMUS AFTER A SINGLE EXPOSURE TO IONIZING RADIATION

Full Text

При нарастающем антропогенном загрязнении окружающей среды проблема альтерации, адаптации и репарации органов иммунной системы в условиях повреждающего действия ионизирующего излучения остается актуальной [9]. В практическом здравоохранении и ветеринарии продолжает существовать потребность в новых эффективных и безопасных методах защиты от γ-облучения - нивелирования его негативных последствий. Морфологические преобразования центральных и периферических органов иммуногенеза, в том числе тимуса, в норме [4, 10] и после воздействия ионизирующего излучения широко освещены в литературе [1, 3]. У различных экспериментальных животных продемонстрирована динамика структурных перестроек тимуса в ответ на действие различных видов и доз ионизирующего излучения. Полученные данные зачастую не позволяют точно предсказать динамику гистопатологических реакций в тимусе при конкретной дозе облучения. Одним из наименее изученных вопросов в данной области следует считать изменения экспрессии различных иммуногистохимических маркеров (в частности CD68 и Ki-67). Цель данного исследования - оценка динамики структурных преобразований и экспрессии маркеров CD68 и Ki-67 в тимусе крыс в различные сроки после однократного тотального облучения в сублетальной дозе. Материал и методы. Исследование проведено на крысах-самцах линии Вистар ювенильного возраста (3-3,5 мес) массой 150-170 г. Животных подвергали однократному воздействию ионизирующего γ-облучения в дозе 5 Гр, которое моделировали на линейном ускорителе Clinac 2100 (Varian, США) на базе Крымского республиканского учреждения «Онкологический клинический диспансер» (г. Симферополь). Использовали следующие параметры ионизирующего излучения: рабочая энергия линейного ускорителя - 6 МэВ, время экспозиции - 50 с, разовая доза - 5 Гр, размер поля - 40 см2, глубина проникновения - 2,5 см. Во время облучения крысы находились в свободном режиме перемещения в пределах специально сконструированного бокса площадью 40 см2, что обеспечивало равномерное воздействие на них ионизирующего излучения. Среди указанных выше параметров ключевым является доза облучения, равная 5 Гр, которая широко используется для моделирования костномозговой формы острой лучевой болезни у крыс. Вместе с тем, выбранная доза для крыс не достигает ЛД50. По различным литературным данным она колеблется от 6 до 8,5 Гр [12], что связано с отсутствием изучения выживаемости экспериментальных животных, а также с необходимостью сохранения численности облучённых крыс на протяжении всего срока эксперимента. На протяжении исследования крыс содержали в стандартных условиях вивария. Затем, на 3-, 7-, 14-еи 30-е сутки после облучения (по 6 животных каждого срока) декапитировали под эфирным наркозом с соблюдением биоэтических требований (в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных»). Контролем служили 6 интактных крыс. Отсутствие сроков наблюдения в интактной серии обусловлено незначительностью преобразований гистологической структуры тимуса в данной возрастной группе крыс на протяжении эксперимента [4]. После взятия тимуса и проведения необходимых макроскопических и органометрических исследований его фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина и по обычной методике заливали в парафин. Серийные гистологические срезы толщиной 4-5 мкм окрашивали гематоксилином - эозином и по Ван-Гизону. Изучение динамики структурных преобразований тимуса после воздействия ионизирующего излучения дополнено данными иммуногистохимического анализа с использованием маркеров Ki-67 (маркер клеточной пролиферации, экспрессирующийся на стадиях клеточного цикла G1, G2, S и во время митоза) и CD68 (панмакрофагальный маркер, экспрессирующийся в моноцитах и макрофагах). Иммуногистохимические реакции проводили на срезах толщиной 3-4 мкм в соответствии с протоколами компании TermoScientific (США), используя систему визуализации Quanto и DAB Chromogen. Положительную реакцию оценивали по желто-коричневому окрашиванию ядра - для маркера Ki-67 (клон sp6, TermoScientific) или цитоплазмы - для маркера CD68 (клон ab-1, TermoScientific). Количественный уровень экспрессии изучаемых маркеров выражали в виде соотношения площади иммунопозитивных ядер/цитоплазмы (для Ki-67 и CD68 соответственно) и иммунонегативной площади (индексы IKi-67 соответственно). Просмотр и получение цифровых фотографий микропрепаратов тимуса осуществляли с помощью цитоморфометрического комплекса Olympus CX-41 (Olympus, Япония) с набором планарных объективов. На гистологических срезах с использованием программного обеспечения ImageJ [11] путем наложения морфометрической сетки измеряли площади основных структур тимуса (капсулы и трабекул, коркового и мозгового вещества) и определяли их относительные площади к общей площади гистологического среза, а также кортико-медуллярный индекс (КМИ). На основании полученных данных в программе Statistica 10.0 (StatSoft, США) строили вариационные ряды, оценивали нормальность распределения по критерию Колмогорова-Смирнова [5], рассчитывали среднее значение и ошибку среднего, определяли значимость отклонений от показателей у интактных крыс с использованием непараметрического U-критерия Манна-Уитни. Критическим уровнем значимости считали р<0,05. Все измерения и исследования производили с использованием средств измерительной техники, прошедших метрологическую поверку, и вспомогательного оборудования, после аттестации на базе отдела морфологии с электронной микроскопией Центральной научноисследовательской лаборатории Медицинской академии им. С. И. Георгиевского ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет им. В. И. Вернадского». Соблюдение основных биоэтических норм при проведении исследования подтверждено заключением комитета по этике ФГАОУ ВО «КФУ им. В. И. Вернадского» (выписка из протокола № 3 от 19.10.2015 г.). Результаты исследования. Полученные результаты свидетельствуют об отчетливо выраженном влиянии γ-облучения на структуру тимуса. При этом наиболее значительные изменения гисто-и цитоархитектоника тимуса претерпевала на 3-и сутки после облучения. Капсула и междольковые перегородки были значительно расширены за счет отека и крайне выраженного полнокровия сосудов стромы. При сохранении, в целом, четкой границы между корковым и мозговым веществом наблюдалась «инверсия» слоев, т. е. корковое вещество выглядело светлее, чем мозговое, с сосредоточением клеток лимфоидного ряда в периваскулярных зонах (рис. 1). Это, вероятно, обусловлено гибелью и миграцией тимоцитов коркового вещества после воздействия ионизирующего излучения. Как в корковом, так и мозговом веществе тимуса обнаружено большое количество клеток, находящихся на различных стадиях митотического деления, а также клеток, гибнущих путем апоптоза. Некоторые участки коркового вещества тимуса были представлены лишь сетью эпителиоретикулоцитов с признаками внутриклеточной дистрофии. На 7-еи 14-е сутки после облучения тимус, в целом, характеризовался восстановлением гистологической структуры. Отличительной особенностью его структурной организации оставалось расширение и полнокровие сосудов микроциркуляторного русла (с наличием, в ряде случаев, очагов выхода форменных элементов крови во внесосудистое пространство) (см. рис. 1, в, г), а также визуальное уменьшение относительного содержания коркового вещества. Начиная с 7-х суток после облучения, популяция тимоцитов в корковом веществе восстанавливалась при наличии всё ещё значительного количества апоптотически гибнущих клеток в окружении активных макрофагов. В корковом веществе преобладали клетки небольшого размера с резко базофильным ядром за счёт гиперконденсации хроматина, а в мозговом - клетки средних размеров в окружении хорошо визуализирующихся клеток микроокружения. При этом в субкапсулярной зоне тимуса отмечалось появление большого количества крупных клеток лимфоидного ряда со слабобазофильным ядром и цитоплазмой (см. рис. 1, в, г), что указывает на активацию процесса внутритимусной пролиферации и дифференцировки костномозговых клеток-предшественников. На 30-е сутки после облучения гистологическое строение тимуса соответствовало таковому у интактных крыс. Перестройка тимуса подтверждалась морфометрическими данными структурно-функциональных зон тимуса (таблица). Так, на 3-и сутки после облучения происходило перераспределение соотношения между основными структурно-функциональными зонами тимуса в сторону стромально-сосудистых компонентов за счет, преимущественно, коркового вещества. На 7-е и 14-е сутки после облучения относительная площадь коркового вещества тимуса была меньше, чем у интактных животных (см. таблицу). При этом доля мозгового вещества на 7-е сутки также уменьшалась по сравнению с таковой у интактных крыс, а на 14-е сутки - увеличивалась. На 30-е сутки после облучения относительная площадь коркового и мозгового вещества значимо не отличалась от таковой у животных. Важно, что общей тенденцией, выявленной во все сроки эксперимента, явилось статистически значимое увеличение относительной площади стромальных образований тимуса по сравнению с таковой у интактных животных. КМИ на 3-, 7-еи 30-е сутки значимо не отличался от такового в контроле, что, несмотря на значительные изменения относительных площадей коркового и мозгового вещества, было связано с однонаправленным перераспределением структурных компонентов тимуса (уменьшением доли коркового и мозгового вещества в пользу стромально-сосудистых компонентов). Иммуногистохимический индекс Ki-67 (IKi-67) в тимусе у интактных крыс составлял 38,8±2,5, 25,16±1,22 и 36,6±1,4 в корковом веществе, мозговом веществе и субкапсулярной зоне соответственно. Экспрессия данного маркера в глубокой зоне коры тимуса не изменялась. При этом в субкапсулярной зоне тимуса экспрессия маркера Ki-67 значимо увеличивалась, а в мозговом веществе - снижалась. Так, в субкапсулярной зоне экспрессия данного маркера пролиферации достигала наибольшей выраженности (рис. 2, а, б). Значения IKi-67 в этой зоне спустя 3, 7 и 30 сут после облучения составляли 63±3, 48,1±2,5 и 58±5 соответственно, превосходя на 71,33 (р<0,05), 31,43 (р<0,05) и 58,71% (р<0,05) таковые у интактных крыс. В мозговом веществе значимо снижался по сравнению с IKi-67 IKi-67 у интактных животных на 7-, 14-еи 30-е сутки на 25,04 (р<0,05), 25,80 (р<0,05) и 16,40% (р<0,05) и составлял 18,9±0,8, 18,7±1,2 и 21,0±1,0 соответственно. Экспрессия цитоплазматического маркера макрофагов CD68 вне зависимости от исследуемой серии экспериментальных животных была выражена в двух зонах тимуса: в субкапсулярной зоне и на границе между корковым и мозговым веществом (в кортико-медуллярной зоне). У интактных крыс иммуногистохимический индекс CD68 (ICD68) в субкапсулярной зоне составил 10,4±1,0, а в кортико-медуллярной зоне - 14,2±1,4. На 3-и сутки после облучения было отмечено статистически значимое увеличение количества CD68-позитивных клеток как в субкапсулярной зоне (ICD68 - 35,4±1,8; на 242,11%), так и в кортико-медуллярной зоне (ICD68 - 22±3; на 56,94%), чем у интактных животных. Полученные данные отражают процесс формирования в периваскулярных пространствах кортико-медуллярной зоны тимуса макрофагально-клеточных инфильтратов, включающих в себя клетки, обладающие фагоцитарнойактивностью. Данныеклетки, по-видимому, привлекаются из периферической крови и костного мозга с целью элиминации утраченной клеточной популяции тимоцитов, а также для формирования пула антиген-представляющих клеток в условиях возросшей потребности в пролиферации и дифференцировке новых тимоцитов. При этом на 7-, 14-еи 30-е сутки после облучения статистически значимых различий в уровне экспрессии CD68 ни в субкапсулярной зоне, ни в кортико-медуллярной зоне выявлено не было, что отчасти связано со значительным уровнем вариации изучаемого показателя. Обсуждение полученных данных. Тимус, являясь центральным органом иммунной системы, одним из первых в организме реагирует на негативные эндо-и экзогенные факторы, среди которых далеко не последнее место занимает воздействие ионизирующего излучения. В качестве предпосылок к изменениям гисто-и цитоархитектоники тимуса в ответ на γ-облучение, в первую очередь, выступает высокая радиационная чувствительность тимоцитов (преимущественно, коркового вещества) [8], а также лабильность клеточной популяции за счет внутритимусной миграции и миграции клеток-предшественников из костного мозга [3]. С другой стороны - принимая во внимание неизбежную активацию гипоталамо-гипофизарнонадпочечниковой оси регуляции с формированием стрессового ответа организма, помимо прямого повреждающего действия ионизирующего излучения на тимоциты, следует учитывать опосредованную глюкокортикоидами активацию апоптоза [6, 7]. Выявленная динамика структурных преобразований тимуса коррелирует с изменениями в периферических органах иммунной системы (брыжеечных лимфатических узлах), полученных в рамках того же эксперимента [2], а также с данными ряда авторов, описывающих регенерацию тимуса после облучения с двухволновой кинетикой [3]. Выявленная динамика экспрессии иммуногистохимических маркеров пролиферации (Ki-67) и макрофагов (CD68), начиная с 7-х суток после облучения, указывает на восстановление клеточной популяции тимуса, утраченной после воздействия ионизирующего излучения. Это происходит за счет привлечения предшественников иммунокомпетентных клеток из красного костного мозга, клеток моноцитарного ряда, а также активации внутритимусной пролиферации лимфоцитов, преимущественно, в его субкапсулярной зоне. Полученные нами результаты дополняют имеющиеся в литературе данные о лучевом поражении тимуса и могут служить в качестве контрольных значений для морфологической оценки эффективности применения тех или иных радиопротекторных/корригирующих средств. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: М.А.К., В.С.П., Г.А.М. Сбор и обработка материала: М.А.К. Статистическая обработка данных: М.А.К. Написание текста: М.А.К., С.А.К., Г.А.М., В.С.П. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

About the authors

M. A. Kriventsov

V.I. Vernadskiy Crimean Federal University

Email: maksimkgmu@mail.ru
Department of Normal Anatomy, S. I. Georgievsky Medical Academy Simferopol, 5/7 Lenina boulevard, Simferopol, Crimea 295000

V. S Pikalyuk

V.I. Vernadskiy Crimean Federal University

Department of Normal Anatomy, S. I. Georgievsky Medical Academy Simferopol, 5/7 Lenina boulevard, Simferopol, Crimea 295000

G. A. Moroz

V.I. Vernadskiy Crimean Federal University

Department of Normal Anatomy, S. I. Georgievsky Medical Academy Simferopol, 5/7 Lenina boulevard, Simferopol, Crimea 295000

S. A. Kutya

V.I. Vernadskiy Crimean Federal University

Department of Normal Anatomy, S. I. Georgievsky Medical Academy Simferopol, 5/7 Lenina boulevard, Simferopol, Crimea 295000

References

Supplementary files