METHODOLOGICAL PECULIARITIES OF THE MORPHOMETRIC CHARACTERIZATION OF HUMAN NEOCORTEX SYNOPTOARCHITECTONICS BASED ON IMMUNOFLUORESCENT DEMONSTRATION OF NEUROMODULIN

Full Text

В связи с малыми размерами синаптических контактов (0,1-0,5 мкм) и терминальных ветвлений аксонов (около 1-3 мкм) основная масса научной информации о них была получена с помощью электронной микроскопии (ЭМ) [4, 5, 10, 11]. Однако с помощью ЭМ трудно дать качественную и количественную характеристики распределения синапсов в пределах крупных анатомических образований мозга (например неокортекса). С этой задачей легко справляются методы световой и иммунофлюоресцентной микроскопии [1, 2, 3, 6]. Для этих целей широко используется иммуногистохимическая реакция на синаптофизин (р38) и нейромодулин (GAP-43) [1]. Реакция на р38 позволяет выявлять локализацию синаптических пузырьков (СП) диаметром 50 нм. Этот белок входит в группу семейства интегральных белков, связанных с мембраной СП, занимает 10% их объема и содержится во всех синапсах [7, 9]. Реакция на GAP-43 позволяет судить о структурно-функциональном состоянии терминалей аксосоматических и аксодендритических синапсов. Это связано с тем, что фосфопротеин GAP-43 является специфичным для мембраны аксонных терминалей ростовым маркером. Наличие в нервной ткани экспрессии GAP-43 является признаком начала образования аксонов в эмбриогенезе и принимает активное участие в процессах регенерации и пластичности нервной ткани [8, 12]. Ранее были изучены возможности морфометрической характеристики синапсов неокортекса человека при иммуногистохимическом выявлении синаптофизина, т. е. СП [2]. Однако СП являются субсистемой синаптической терминали и в большей степени характеризуют ее везикулярный пул. Кроме того, СП - очень вариабельные структуры и подвергаются светлому типу деструкции уже на раннем этапе постишемического периода, когда синаптическая терминаль остается относительно сохранной [4]. В связи с этим было целесообразно изучить возможности морфометрической характеристики синаптоархитоники с помощью иммуногистохимического выявления GAP-43, что и явилось целью настоящей работы. Работа выполнена на базе ФГБОУ ВО «Омского государственного медицинского университета». Материал для гистологического исследования получен в Омском областном бюро судебно-медицинской экспертизы. Данное исследование одобрено этическим комитетом Омского государственного медицинского университета (протокол № 61 от 19.06.2014 г.). Для исследования использован аутопсийный материал (5-10 ч после смерти) из поля 4 (по Бродману) коры большого мозга (КБМ) людей, погибших в результате несчастных случаев (n=4, мужчины 23-45 лет). Мозг фиксировали в 4% растворе параформа на 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,2-7,4) при температуре 4 ºС в течение 1 сут и заключали в парафин. Изготавливали серийные фронтальные срезы толщиной 10 мкм через все слои и помещали их на предметные стекла. Для флюоресцентного иммуногистохимического исследования использовали первичные кроличьи поликлональные антитела (ImG) к нейромодулину (GAP-43). Для визуализации иммунной реакции были использованы козлиные поликлональные вторичные антитела к иммуноглобулину кролика (Abcam, Англия), (разведение 1:200). Антитела были ассоциированы с флюоресцентным красителем техасский красный (Texas Red® Sulfonyl Chloride) (Abcam, Англия). Препараты просматривали, используя конфокальный лазерный сканирующий микроскоп, присоединенный к флюоресцентному микроскопу Bio-Rad MRC 600 CLSM Nikon FXA (Nikon, Япония). Использовали аргонно-криптоновый лазер с фильтром для флюоресцеинизотиоцианата (488DF-10) и липофусцина (568DF- 10). Применялась двухканальная флюоресценция (увеличение линзы - 20, объектив Nikon; Fluor 1.30), шаг просмотра срезов - 2 мкм, увеличение поля - 3, средняя плотность - 1. Использован режим быстрого просмотра (10 просмотров каждого среза) с помощью фильтров Калмана с коэффициентом 3 и размером блока ¼ и дальнейшим сохранением данных в памяти компьютера. Единица сканирования матрицы (пиксель) была 0,49×0,49 мкм. Иммунофлюоресценцию и липофусциновую флюоресценцию сначала регистрировали с использованием фильтра 488DF-10 через 1-й канал (зеленый) с получением изображения 5-10 Z-серийных участков, затем эту же область исследовали для выявления липофусцина - с фильтром 568DF-10 через 2-й канал (красный). Формировали графические файлы, а затем на них с помощью программы ImageJ 1.46 анализировали изображение меченых синапсов. Проверку статистических гипотез проводили при помощи программы Statistica 8.0 с использованием непараметрического U-критерия Манна- Уитни и Колмогорова-Смирнова (для парного сравнения), критерия χ2 (относительные величины). Нулевую гипотезу отвергали при статистической значимости p<0,05. В ходе морфометрического анализа определяли следующие характеристики: количество и площадь частиц в поле зрения, их средний и наименьший размеры, их относительную площадь, общую численную площадь (ОЧП) терминалей. При исследовании слоя V неокортекса было обнаружено, что иммунофлюоресцентная реакция GAP-43 маркировала мелкие, средние и крупные структуры в нейропиле и на телах нейронов (рис. 1). Преобладали нейроны с интенсивным дискретным свечением GAP-позитивного материала на всей поверхности перикариона. Нейропиль неокортекса содержал многочисленные четкие гранулы продукта иммуногистохимической реакции, преимущественно округлой формы. GAP-43позитивные структуры в нейропиле располагались неравномерно в виде интенсивно флюоресцирующих гранул (см. рис. 1). На первом этапе при автоматическом анализе частиц на масках изображений их размер и форма не лимитировались. Это позволило отразить все составляющие реального изображения GAP-43-позитивных структур. Так, на рис. 2 все такие структуры (терминали аксосоматических и аксодендритических синапсов) в зависимости от конечного разрешения изображения занимали 6,4 (разрешение 72 пикс. /дюйм), 6,9 (300 пикс. /дюйм) 9,5 (600 пикс. /дюйм) и 13,7% (900 пикс. /дюйм) поля зрения. На втором этапе определялись только округлые частицы, отображающие GAP-43позитивные структуры нейропиля (терминали аксошипиковых и аксодендритических синапсов) (см. рис. 2, б). Структуры нейропиля занимали 1,6 (разрешение 72 пикс. /дюйм), 1,9 (300 пикс. / дюйм), 2,6 (600 пикс. /дюйм) и 3,4% (900 пикс. /дюйм) поля зрения (98 304 мкм2). Таким образом, количество и площадь частиц различных размеров и формы в маске реального изображения нейропиля зависели от его конечного разрешения (72, 300, 600 или 900 пикс. / дюйм). Наиболее высокие значения общей площади и численной плотности частиц нейропиля получены при разрешении 600 и 900 пикс. /дюйм (табл. 1). Таким образом, с помощью флюоресцентного иммуногистохимического выявления нейромодулина при использовании конфокального микроскопа и высокого (600-900 пикс. /дюйм) конечного разрешения цифрового изображения удалось выявить в нейропиле неокортекса флюоресцирующие частицы размером менее 1 мкм2 (≥0,02 мкм2). Однако эти частицы составляли не более 2,5% от всех выявленных. Основная масса флюоресцирующих структур была представлена частицами размером 0,1-3,0 мкм2 - это, вероятно, терминали и их конгломераты с диаметром от 0,4 до 2,0 мкм. При конечном разрешении 900 пикс. /дюйм ОЧП терминалей в нейропиле КБМ была 2,7±0,5 на 100 мкм2, эти терминали занимали 35,8% площади всего GAP-43-позитивного материала. Остальную площадь (64,2%) занимали терминали на перикарионах и крупных дендритах. При иммунофлюоресцентном выявлении GAP-43 популяция очень мелких (<0,1 мкм2) терминалей выявлялась лишь частично (10-20%). Вполне вероятно, что это было связано с недостаточной энергией флюоресцирующих молекул и низкой разрешающей способностью микроскопа. Кроме того, при просмотре срезов с шагом в 2 мкм некоторые терминали просто накладывались друг на друга и не могли быть идентифицированы по отдельности. Увеличение разрешения конечного изображения от 72 до 900 пикс. /дюйм способствовало более точному определению ОЧП терминалей - от 929 до 2650 в поле зрения (в 2,85 раза). Относительная площадь выявленных частиц при этом увеличивалась не прямо пропорционально - от 1,6 до 3,4% (в 2,13 раза) (см. табл. 1). Распределение частиц (одиночных терминалей и групп), выявленных на масках реального изображения нейропиля, по размерам площадей представлено в табл. 2. При исходном (72 пикс. / дюйм) разрешении конечного изображения терминали площадью <1,0 мкм2 не выявлялись, а были, вероятно, представлены в составе более крупных частиц. Увеличение разрешения до 300, 600 и 900 пикс. /дюйм приводило к детализации изображения и статистически значимому увеличению количества мелких частиц, при этом доля крупных частиц уменьшалась (см. табл. 2). Сложность изучения аксосоматических синапсов заключалась в том, что GAP-43-позитивные структуры, представляющие терминали, на перикарионах большинства нейронов сливались в флюоресцирующие неструктурированные конгломераты высокой яркости (рис. 3, а, б). С помощью автоматизированного анализа в составе такого конгломерата сложно определить форму и размеры образующих его структур. Для решения этой задачи в ручном режиме выделяли участки перикарионов, на которых были видны отдельные частицы округлой формы. Только после этого проводили морфометрический анализ (см. рис. 3, а). Минимальная площадь отдельных частиц на перикарионах нейронов составляла 0,40 мкм2 (диаметр 0,7 мкм), средняя - 2,40 мкм2 (диаметр 1,75 мкм), а максимальная - 4,20 мкм2 (диаметр 2,30 мкм). Чаще всего встречались округлые терминали площадью 1,50-2,20 мкм2. Из них формировались более крупные неправильной формы конгломераты, частично или полностью покрывающие тела нервных клеток (см. рис. 3, а, б). ОЧП аксонных терминалей на единице плоскости перикариона пирамидных нейронов (в конгломератах) составляла 103±33/100 мкм2, а в начальном сегменте апикальных дендритов - только 14,2±4,4/100 мкм2. В совокупности аксосоматические и аксодендритические синапсы на крупных дендритах (по изучению 50 полей зрения) составляли 49,7-77,5% (95% доверительный интервал) всей площади GAP-43-позитивных структур слоя V неокортекса человека в норме, а все остальные - 22,7-50,6%. Выявлена закономерность: чем дальше от тела нейрона, тем меньше ОЧП терминалей на единицу площади/объема отдела (тело - 103±33/100, крупные дендриты - 14,2±4,4, нейропиль - 2,7±0,5/100 мкм2). При этом площадь рецептивного поля в основных отделах нейрона различалась менее значительно. Это свидетельствовало о том, что синапсы, локализованные на перикарионе и крупных дендритах за счет большой плотности, имели более высокую информационную емкость и влияние на пирамидный нейрон, чем аксошипиковые синапсы. Таким образом, при иммунофлюоресцентном исследовании GAP-43 можно получить объективную информацию о расположении и площади аксошипиковых, аксодендритических и аксосоматических синапсов. Однако существуют ограничения при определении численной плотности мелких терминалей (<1 мкм2). Вероятно, это могло быть связано с недостаточной интенсивностью свечения небольших скоплений флюоресцирующих молекул, относительно низкой разрешающей способностью микроскопа и матрицы цифровой камеры, слиянием изображений соседних ярко святящихся терминалей в однородные конгломераты, вертикальным наложением терминалей разных уровней сканирования [1-3]. Частично решить эту проблему удалось путем увеличения разрешения конечного изображения до 600-900 пикс. /дюйм. Однако и при этих разрешениях выявлялись только 10-20% самых мелких терминалей (<0,01 мкм2). В результате этого в нейропиле (место локализации мелких синапсов) ОЧП терминалей (маркированных GAP-43частиц) была меньше (2,7±0,5/100 мкм2), чем при ЭМ (15-18/100 мкм2) [4]. Подобный подход использовался ранее при изучении синапсов слоя III лобной КБМ человека с помощью иммуногистохимического выявления синаптофизина [2]. Авторам удалось выявить ОЧП синапсов на уровне 1,0/100 мкм2, что близко по значению к нашим результатам. Еще одна методическая проблема была связана с выявлением отдельных терминалей в составе больших интенсивно флюоресцирующих конгломератов GAP-43-позитивных структур на перикарионах. Возможным решением этой проблемы было уменьшение толщины среза сканирования или использование для морфометрии периферических зон конгломератов, в которых были видны отдельные терминали. По размерам этих терминалей удалось выявить очень высокую плотность аксосоматических синапсов на пирамидных нейронах моторной КБМ человека - 103±33/100 мкм2. О высокой общей численной плотности аксосоматических синапсов свидетельствуют также и литературные данные [10, 11]. Полученные нами результаты необходимо учитывать при изучении синаптоархитектоники неокортекса с помощью иммуногистохимических методов изучения структур синапсов. Эти методы позволяют получить точные объективные данные о содержании синаптических белков в больших объемах нервной ткани, а также проводить выявление синапсов на перикарионах и дендритах нейронов. Однако для детального изучения численной плотности и расположения мелких синапсов необходимы дополнительные методы (реконструкция по серийным срезам, электронная, флюоресцентная микроскопия высокого разрешения). Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: А. С. С., В. А. А., С. С. С., Д. Б. А. Сбор и обработка материала: А. С. С., Д. Б. А. Статистическая обработка данных: А. С. С., В. А. А., С. С. С., Д. Б. А. Написание текста: А. С. С., В. А. А., С. С. С., Д. Б. А. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

About the authors

A. S. Stepanov

Omsk State Medical University

Email: ctepan55@yandex.ru
Department of Histology, Cytology and Embryology

V. A. Akulinin

Omsk State Medical University

Email: akulinin@omsk-osma.ru
Department of Histology, Cytology and Embryology

S. S. Stepanov

Omsk State Medical University

Email: serg_stepanov@mail.ru
Department of Histology, Cytology and Embryology

D. B. Avdeyev

Omsk State Medical University

Email: avdeev86@inbox.ru
Department of Histology, Cytology and Embryology

References

Supplementary files