DEMONSTRATION OF WEIBEL-PALADE BODIES USING VON WILLEBRAND FACTOR IMMUNOCYTOCHEMISTRY AND CONFOCAL LASER MICROSCOPY

Full Text

Тельца Вейбеля-Паладе - это особые цитоплазматические включения в эндотелиоцитах кровеносных сосудов [13]. Они хранят большое число биологически активных веществ, оказывающих существенное влияние на процессы новообразования сосудов [2, 10]. Одним из таких веществ является высокомолекулярный гликопротеин, участвующий в сосудистотромбоцитарном (первичном) и коагуляционном (вторичном) гемостазе - фактор Виллебранда (ФВ) [9]. При стимуляции эндотелия (гипоксия, механическая травма, циркулирующие иммунные комплексы и др.) происходит повышение синтеза ФВ и его высвобождение из телец Вейбеля- Паладе, что позволяет считать этот белок одним из важнейших маркеров функционального состояния (активации/повреждения) эндотелия [8, 12]. В настоящее время исследование структурной организации телец Вейбеля-Паладе осуществляется в основном посредством электронной микроскопии [1, 5, 6]. Однако этот метод требует трудоемких способов обработки материала и не позволяет оценить качественные и количественные характеристики распределения субклеточных структур в пределах клетки в целом. Кроме того, зачастую остается непонятным действительно ли выявленные находки отражают функциональное состояние изучаемых объектов или регистрировались артефактные изменения их структуры, связанные с особенностями фиксации материала, проводки и его последующего контрастирования. Это обстоятельство требует использования при изучении телец Вейбеля- Паладе в сосудах разного типа современных высокоинформативных и адекватных методов, которые позволяли бы проводить сравнительные исследования на млекопитающих разных видов в норме и при патологии. Цель настоящего исследования состояла в выяснении возможности использования иммуноцитохимической реакции на ФВ для анализа особенностей локализации телец Вейбеля-Паладе в эндотелии вен с использованием конфокальной лазерной микроскопии. В работе исследованы фрагменты большой подкожной вены человека (n=5) из архива отдела общей и частной морфологии Института экспериментальной медицины. Программа исследований имеет положительное заключение локального этического комитета ФБГНУ «Института экспериментальной медицины» № 2/16 от 12.05.2016 г. Материал фиксировали в цинк-этанолформальдегиде, который обеспечивает лучшее сохранение антигенов, чем другие методы фиксации [4]. Обезвоживали материал и заливали его в парафин по общепринятой методике. Изготавливали срезы толщиной 5 и 15 мкм и наклеивали на адгезивные предметные стекла Polysine (Menzel-Gläser, Германия). Прежде чем приступить к работе на конфокальном микроскопе, срезы сосудов были изучены с использованием иммунопероксидазной реакции и микроскопии в проходящем свете. Для этого была проведена иммуноцитохимическая реакция на ФВ с использованием первичных поликлональных кроличьих антител (Dako, Дания) и вторичных антител, конъюгированных с полимером и пероксидазой (EnVision+ System Labelled Polymer-HRP Anti-Rabbit, Dako, Дания). Перед инкубацией срезов с первичными антителами была проведена инкубация предметных стекол с депарафинированными срезами в предварительно подогретом в термостате 60 ºС модифицированном цитратном буфере pH 6,1 S1700 (Dako, Дания) в пароварке в течение 20 мин. Для блокирования эндогенной пероксидазы срезы инкубировали в 3% растворе перекиси водорода, а для блокирования неспецифических сайтов связывания антигена - в специальном блокировочном растворе «Protein Block» (Spring Bioscience, США). Пероксидазную метку выявляли, используя рабочий раствор 3,3’-диаминобензидина, приготовленный из набора DAB+ (Dako, Дания). Микроскопию в проходящем свете и фотосъемку выполняли, используя микроскоп Leica DM750 и цифровую фотокамеру ICC50 (Leica, Германия). Для анализа полученных изображений использовали программу LAS EZ (Leica, Германия). При подготовке препаратов для конфокальной микроскопии срезы обрабатывали первичными антителами к ФВ, предварительно проводя тепловое демаскирование согласно описанному выше варианту. После этого проводили обработку срезов вторичными биотинилированными антителами из набора LSAB2 System-HRP (Dako, Дания) и стрептавидином, конъюгированным с флюоресцентным красителем карбоцианином (Cy2; Jackson ImmunoResearch, США). Затем ядра клеток докрашивали флюоресцентным ядерным красителем 7-аминоактиномицином D (7-AAD). По окончании окраски препараты заключали в водорастворимую среду Fluorescence Mounting Medium (Dako, Дания). Препараты исследовали при помощи конфокального лазерного микроскопа LSM-710 (Zeiss, Германия), оснащенного аргоновым (488 нм) и твердотельным (561 нм) лазерами для возбуждения флюоресценции Су2 и 7-AAD соответственно. Трехмерную реконструкцию выявляемых структур проводили с использованием компьютерной программы Zen-2011 (Zeiss, Германия). Морфометрию производили с помощью компьютерной программы LSM Image Browser (Zeiss, Германия). На световом уровне положительная реакция на ФВ отмечается в эндотелиоцитах как эндотелия самой вены, так и небольших кровеносных сосудов (vasa vasorum), расположенных в стенке вены, а также в единичных пристеночных тромбах. В субэндотелиальном слое наблюдается градиентное распределение ФВ. В отдельных клетках мелких сосудов наблюдается структуризация ФВ в виде небольших гранул. В субэндотелиальном слое этих сосудов продукт реакции отсутствует. В эндотелии крупных сосудов плотность расположения продукта реакции не позволяет определить его структуру, тогда как в субэндотелиальном слое отчетливо просматривается неравномерное постепенное понижение интенсивности реакции на ФВ (рис. 1). В результате проведения конфокальной лазерной микроскопии при использовании иммерсионного объектива (ув. 100) в эндотелии, субэндотелиальном слое, а также в пристеночных тромбах был обнаружен продукт иммунофлюоресцентной реакции. В эндотелии он имел вид многочисленных, отграниченных друг от друга флюоресцирующих гранул различной формы (в зависимости от плоскости среза сосуда), которые имеют разные размеры от 0,1×0,2 до 1,3×3,7 мкм (рис. 2, а). На одиночных оптических срезах и небольших Z-сериях плоскостных срезов, полученных при высоком разрешении конфокального микроскопа, видно, что эти гранулы, собираясь в крупные конгломераты, расположены хаотично преимущественно в периферических зонах эндотелиоцитов. Меньшая их часть образуют один неплотно прилегающий к ядрам эндотелиоцитов циркулярный слой; при этом тельца здесь имеют палочковидную форму и продольную ориентацию относительно длинника ядра (т. е. параллельно кровотоку) (см. рис. 2, б). Тромботические массы представляют собой бесструктурный, однородный, равномерно окрашенный конгломерат. В настоящее время известно, что в сосудах ФВ локализуется как внутри эндотелиоцитов, так и в субэндотелиальном слое. При этом, если внутриклеточное (в составе телец Вейбеля-Паладе) содержание ФВ обусловливает непосредственное участие этого белка в обеспечении гемостаза, то функциональная роль субэндотелиальной локализации ФВ кажется непонятной. Оказывается, присутствие ФВ в субэндотелиальном слое внутренней оболочки неповрежденного кровеносного сосуда обеспечивает выполнение важной функции - прикрепления эндотелиоцитов к базальной мембране благодаря его способности связываться с коллагеном IV типа [12]. При повреждении эндотелия этот комплекс играет одну из ключевых ролей в обеспечении адгезии пристеночного тромба [14]. Существуют несколько морфологических способов выявления ФВ в клетках эндотелия in situ. Один из них представляет собой трудоемкий способ выявления телец Вейбеля-Паладе при помощи электронной микроскопии. Этот метод позволяет точно визуализировать организованные в трубчатые структуры мультимеры ФВ, содержащиеся в тельцах Вейбеля- Паладе, но не дает возможности оценить общее распределение ФВ вне этих органелл как внутри клетки, так и в субэндотелиальном слое. Кроме того, при электронной микроскопии не всегда удается определить тельца Вейбеля- Паладе [3], возможно это связано с особенностями восприятия этими ультраструктурами контрастирующих веществ. Иммуноцитохимический метод определения ФВ имеет ряд преимуществ, поскольку в настоящее время в распоряжении исследователей имеется большой набор высокоспецифичных моноклональных и поликлональных антител к ФВ, которые выпускаются рядом фирм-производителей иммуноцитохимических реагентов (AbCam, Spring Bioscience, Dako и др.). Многие из них универсальны, имеют широкую иммунореактивность и позволяют выявлять ФВ как у человека, так и у лабораторных животных, даже после довольно жесткой фиксации 4% параформальдегидом. Высокое сродство к антигену позволяет избегать процедуры теплового демаскирования, которая, впрочем, способна улучшить качество реакции. В целом, методы иммуноцитохимии менее трудоемки, хорошо воспроизводимы, высокоселективны и позволяют наблюдать продукт реакции на значительной площади среза. Однако недостаточно высокое разрешение светового микроскопа не дает возможности детально изучать распределение и локализацию ФВ в отдельных клетках. Конфокальная лазерная микроскопия (благодаря увеличению разрешающей способности в 1,4 раза по сравнению с обычной световой микроскопией) в известном смысле сочетает в себе преимущества описанных выше двух методов. В представленном варианте обработки при постановке иммунофлюоресцентной реакции можно эффективно использовать более толстые срезы (свыше 10 мкм). Для выявления детальной локализации флюоресцирующей метки можно изучать отдельные оптические срезы в сочетании с построением пространственных реконструкций. Достаточно высокое разрешение конфокального лазерного микроскопа позволяет оценить содержание телец Вейбеля-Паладе в отдельных микрососудах, а двойная реакция на ФВ и белок клеточных контактов β-катенин [7] - определить их локализацию в отдельных клетках. Также при помощи конфокальной лазерной микроскопии можно проводить и количественный анализ содержания телец Вейбеля-Паладе [11]. Таким образом, использование конфокальной лазерной микроскопии для выявления таких малых объектов, какими являются тельца Вейбеля-Паладе, имеет ряд преимуществ, обусловленных возможностью достигать более высокого разрешения, чем обычная световая микроскопия, для оценки детальной локализации продукта реакции и получать препараты, пригодные для проведения сравнительного количественного анализа. Работа выполнена в рамках Государственного задания ФГБНУ «Института экспериментальной медицины» на поисковые научные исследования. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: Д. Э. К. Сбор и обработка материала: О. В. К. Анализ и интерпретация данных: О. В. К., Е. Г. С. Написание текста: Д. Э. К., Е. Г. С. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

About the authors

Ye. G. Sukhorukova

RAS Institute of Experimental Medicine

Email: len48@inbox.ru
Laboratory of Functional Morphology of Central and Peripheral Nervous System, Department of General and Special Morphology

O. V. Kirik

RAS Institute of Experimental Medicine

Email: iemmorphol@yandex.ru
Laboratory of Functional Morphology of Central and Peripheral Nervous System, Department of General and Special Morphology

D. E. Korzhevskiy

RAS Institute of Experimental Medicine

Email: dek2@yandex.ru
Laboratory of Functional Morphology of Central and Peripheral Nervous System, Department of General and Special Morphology

References

Supplementary files