REACTION OF TESTICULAR MAST CELLS TO STRESS OF DIFFERENT INTENSITY

Full Text

Бесплодие - не только важная медицинская, но и серьезная социальная проблема. Согласно международным исследованиям, с проблемой бесплодия сталкиваются от 15 до 20 % пар, при этом в половине случаев это связано с нарушением репродуктивного здоровья мужчин. Несмотря на совершенствование методов клинико-лабораторного обследования пациентов и разработку новых методов их лечения, нарушения фертильности мужчин не имеют тенденции к снижению [1, 4]. В качестве факторов, способствующих данной патологии, рассматриваются и стрессорные факторы, к числу которых относят и физические нагрузки. Становится все более очевидным, что влияние иммунной системы на функции гонад существует. К иммунорегуляторным клеткам относятся тучные клетки (ТК). Они составляют гетерогенную клеточную популяцию, отличающуюся по структурно-функциональным свойствам в разных органах и тканях [3, 5, 6, 9, 13]. В норме число ТК в семенниках весьма ограничено, и в основном эти клетки находятся в области семенниковой капсулы вокруг субкапсулярных кровеносных сосудов [8, 11]. Их количество варьирует в зависимости от возраста [10]. Известно, что у бесплодных лиц отмечается значительное возрастание числа ТК [15]. В физиологических условиях участие ТК в регенерации яичка обеспечивается различными механизмами, модулирующими стероидогенез. Известно, что у хомяков выработку тестостерона стимулирует гистамин, в то время как фактор некроза опухолей-α и серотонин ингибируют тестикулярный стероидогенез. Наличие вазоактивных веществ в ТК, а также преимущественное расположение вокруг кровеносных сосудов предполагает их вовлечение и в регуляцию кровотока [7, 12]. Относительно низкое число и ограниченное распространение ТК в нормальных семенниках, как полагают, является одной из основных особенностей иммунной привилегии [14]. Известно, что физиологическая активность ТК меняется при стресс-реакциях. Однако при всем объеме существующей информации нет подробного исследования, касающегося роли ТК в регуляции восстановительных процессов семенника после стресса. В связи с этим цель настоящего исследования - изучение реакции ТК семенников на стрессовые факторы разной интенсивности. Материал и методы. Исследовали семенники 20 половозрелых крыс-самцов линии Вистар массой 370- 520 г. Условия содержания и обращение с животными соответствовали Директиве Европейского парламента и Совета от 22 сентября 2010 г. «О защите животных, которых используют для научных целей» (2010/63/EU). В качестве стресс-воздействия использовали плавание - дозированную физическую нагрузку, вызывающую стресс у крыс. На проведение данного экспериментального исследования получено разрешение локального этического комитета Института иммунологии и физиологии Уральского отделения РАН (протокол № 10 от 03.06.2016 г.). Экспериментальные животные были разделены на 4 группы, подвергавшиеся нагрузкам разной интенсивности: 1) интактные крысы (n=5); 2) крысы, которых подвергали 6-дневному плаванию в течение 2 ч на протяжении 4 нед (умеренная интенсивность нагрузки, n=5); 3) крысы, подвергавшиеся 5-дневному 6-часовому плаванию на протяжении 4 нед по схеме - 3 подхода по 2 чс 30-минутным отдыхом (нагрузка высокой интенсивности, n=5); 4) крысы, которых подвергали 6-дневному плаванию с грузом 20 % от массы тела на протяжении 4 нед по схеме - 5 подходов по 60 сс 3-минутным отдыхом (нагрузка максимальной интенсивности, n=5). Животных выводили из эксперимента через 4 нед путем передозировки эфирного наркоза. Для гистологического исследования семенники фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина. После стандартной гистологической проводки на автомате закрытого типа Shandon Excelsior (MICROM International GmbH, Германия) семенники заливали в парафин с помощью станции для заливки биологических тканей EG 1160 (Leica, Германия). Полученные парафиновые блоки нарезали на полуавтоматическом микротоме Thermo scientific Microm HM 450 (MICROM International GmbH, Германия), толщина срезов составляла 4-5 мкм. Для морфометрических исследований препараты окрашивали гематоксилином - эозином, ТК выявляли толуидиновым синим. С помощью светового микроскопа Leica DFC 420 (Leica, Германия) производили оценку сперматогенеза по следующим показателям: средний индекс сперматогенеза, среднее число сперматогоний в канальце, диаметр семявыносящего канальца, площадь поперечного сечения семенного канальца, количество нефункционирующих канальцев. Индекс сперматогенеза J рассчитывали на поперечном срезе семенника по 4-балльной системе (с учетом количества слоев эпителиальных клеток в каждом канальце). Средний индекс сперматогенеза J определяли по формуле: J=∑a/А, где а - количество рядов эпителиосперматогенного слоя, А - количество подсчитанных канальцев. Подсчет ТК в семенниках проводили на единицу площади с пересчетом на 1 мм2. Для оценки синтетической активности ТК подразделяли на 4 типа. К 1-му типу относили клетки с малым содержанием гранул секрета в цитоплазме, который располагался околомембранно. Тип 2 включал клетки с хорошо дифференцированной гранулярностью в цитоплазме и диффузным расположением гранул. К типу 3 относили крупные клетки с плотным и диффузным расположением гранул в цитоплазме. К нулевому типу относили дегранулированные клетки с признаками нарушения целостности цитоплазматической мембраны и выделения в окружающее тканевое пространство цитоплазматических гранул. Для определения синтетической активности вычисляли средний гистохимический коэффициент (СГК) по формуле: СГК=(3n+2n+1n+0n)/100, где 3n, 2n, 1n и 0n - соответственно число клеток типа 3, 2, 1 или 0 согласно классификации, приведенной выше, 100 - общее число подсчитанных клеток в группе. Для оценки функциональной активности по выбросу гранул ТК в межклеточное пространство использовали индекс дегрануляции (ИД, %), который рассчитывали по формуле: ИД=Д/(Д+Н)×100, где Д - число ТК с явными признаками дегрануляции, Н - число неактивированных ТК. Концентрацию тестостерона в крови определяли методом иммуноферментного анализа на автоматическом фотометре (BioTek ELx 808, США) с помощью набора реагентов (Тестостерон-Имаксиз, Россия). Статистическую обработку данных проводили с помощью программ Past 3.15 и «Statistica 8.0». Значимость различий между сравниваемыми группами определяли с использованием критериев Фридмана, Краскела-Уоллиса, Манна- Уитни при р<0,05. Результаты исследования. В извитых семенных канальцах семенников интактной группы животных обнаруживались все типы клеток сперматогенного слоя, а также клетки Сертоли. На препаратах семенников ТК удалось выявить, используя толуидиновый синий. ТК в семенниках интактных крыс имели овальную форму и располагались исключительно в оболочке. Этих клеток мало, и они обладали небольшой функциональной активностью (рисунок, а). У крыс после нагрузки умеренной интенсивности не выявляли изменений в коэффициентах массы семенников. Почти все исследуемые показатели сперматогенеза оставались на уровне интактных животных, однако наблюдалось значимое увеличение среднего числа нормальных сперматогоний, относящихся к пулу стволовых клеток и участвующих в формировании 2-, 3-го и 4-го рядов эпителиосперматогенного слоя. Концентрация тестостерона в крови самцов после исследуемого типа нагрузки достоверно не изменялась. Между показателями ТК семенников интактных крыс и группы животных после умеренной нагрузки различия не наблюдались (таблица). ТК были представлены преимущественно клетками 3-го типа (см. рисунок, б). После высокоинтенсивной нагрузки у крыс отмечали значимое снижение среднего индекса сперматогенеза по сравнению с контролем, что явилось следствием повреждений эпителиосперматогенного слоя. Среднее число нормальных сперматогоний незначительно снижалось вследствие нарушений в пуле стволовых клеток яичка, были выявлены единичные нефункционирующие канальцы, отмечалось снижение концентрации тестостерона в крови. По данным морфометрии, число ТК в яичках крыс, подвергшихся нагрузке высокой интенсивности (см. рисунок, в), а также гистохимический коэффициент в среднем снижались по сравнению с интактной группой, тогда как индекс дегрануляции оставался без изменений (см. таблицу). Коэффициент массы семенников не отличался у крыс интактной группы и группы после нагрузки максимальной интенсивности. В то же время, у экспериментальной группы животных обнаруживалось значимое снижение среднего индекса сперматогенеза, указывающее на ухудшение репродуктивной функции самцов. Однако диаметр семенных канальцев и сперматоцитограмма свидетельствовали о том, что эти изменения не критичны для мужской половой системы. Значимых различий в концентрации тестостерона нет, однако тенденция к снижению, имеющая место уже при умеренной нагрузке, сохранялась. В среднем у крыс после нагрузки максимальной интенсивности (см. рисунок, г) значимо снижался гистохимический коэффициент и увеличивался индекс дегрануляции ТК в семенниках, тогда как среднее число ТК в 1 мм2 оставалось без изменений (см. таблицу). Обсуждение полученных данных. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что у крыс при стрессе в виде умеренных физических нагрузок морфофункциональные показатели сперматогенеза незначительно отличаются от таковых в интактной группе, изменения в тучноклеточной популяции семенников не наблюдаются, а функций репродуктивной системы самцов сохраняются. Это соответствует известным данным о том, что при умеренных многократных воздействиях развивается адаптивная реакция, что, в конечном счете, приводит к резистентности организма к данному раздражителю [2]. При продолжительных нагрузках высокой интенсивности отмечается ухудшение генеративной функции семенников, проявляющееся в уменьшении индекса сперматогенеза, числа нормальных сперматогоний и появлении нефункционирующих пустых канальцев. Одновременно с этим наблюдается снижение числа ТК и их синтетической активности в семенниках. Последнее, вероятно, является результатом ингибирующего влияния гормонов стресса (катехоламинов и кортикостероидов) на ТК. Снижение числа ТК может быть обусловлено их перераспределением в организме в результате миграции к наиболее интенсивно работающим в данный момент органам и усилением регулирующего влияния ТК в них. Однако последнее предположение требует специального изучения. При краткосрочных физических нагрузках максимальной мощности, вызывающих повышенный стресс для организма, наблюдается ухудшение сперматогенеза, наряду с этим число ТК в семенниках не изменяется, однако резко возрастает их функциональная активность. Клетки начинают активно дегранулировать. Такая реакция ТК в яичках крыс после нагрузки максимальной интенсивности, вероятно, связана с модулирующим влиянием их на стероидогенез, а также регуляцией кровотока в изучаемом органе. Таким образом, умеренные физические нагрузки, ведущие к формированию долговременных адаптационных реакций, не вызывают изменений сперматогенеза и ТК в семенниках, тогда как излишне напряженные тренировки, характеризующиеся как нагрузки максимальной интенсивности, приводят к срыву адаптации и препятствуют нормальному функционированию семенных канальцев. Отмеченные изменения при длительных нагрузках высокой интенсивности протекают на фоне уменьшения как числа ТК, так и их синтетической активности, а при краткосрочных нагрузках максимальной интенсивности - только на фоне снижения функциональной активности ТК. Работа выполнена в рамках программы УрО РАН «Фундаментальные науки - медицине» № 15-3-4-24. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: Ю. С. Х., Н. В. Т. Сбор и обработка материала: Ю. С. Х., Н. В. Т., М. А. Ж. Статистическая обработка данных: Ю. С. Х., Н. В. Т., М. А. Ж. Анализ и интерпретация данных: Ю. С. Х., Н. В. Т., Б. Г. Ю. Написание и редактирование текста: Ю. С. Х., Н. В. Т., Б. Г. Ю. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

About the authors

Yu. S. Khramtsova

Ural Branch of RAS Institute of Immunology and Physiology; Ural Federal University

Email: hramtsova15@mail.ru
Laboratory of Immunophysiology and Immunopharmacology; Department of Biology and Fundamental Medicine 106, Pervomaiskaya St., Yekaterinburg 620049; 19 Mira Str., Yekaterinburg », 620002

N. V. Tyumentseva

Ural Branch of RAS Institute of Immunology and Physiology

Laboratory of Immunophysiology and Immunopharmacology 106, Pervomaiskaya St., Yekaterinburg 620049

B. G. Yushkov

Ural Branch of RAS Institute of Immunology and Physiology; Ural Federal University

Laboratory of Immunophysiology and Immunopharmacology; Department of Biology and Fundamental Medicine 106, Pervomaiskaya St., Yekaterinburg 620049; 19 Mira Str., Yekaterinburg », 620002

M. A. Zhilyakova

Ural Federal University

Department of Biology and Fundamental Medicine 19 Mira Str., Yekaterinburg », 620002

References

Supplementary files