EARLY STAGES OF REGENERATION HISTOGENESIS IN PERIOSTAL PART OF BONE CALLUS IN MAN

Full Text

Несмотря на внедрение в клиническую практику современных методов хирургического лечения переломов и костных дефектов, нарушение их консолидации различной степени выраженности развивается у 5-48 % пациентов [4]. Это обуславливает необходимость проведения фундаментальных исследований регенерации костной ткани, направленных на определение «мишеней» для терапевтической коррекции нарушения консолидации [2]. Известно, что одним из основных этапов восстановления костной ткани является ангиогенез - формирование и рост сосудов, обеспечивающих оксигенацию, миграцию и хоуминг в зоне повреждения клеток-предшественниц, способных к дифференцировке в остеобластическом направлении [1]. Низкий уровень перфузии является одним из основных факторов развития «остеогенной недостаточности» - состояния, при котором собственный камбиальный резерв остеогенных клеток не в состоянии обеспечить процесс остеорепарации [3]. Таким образом, регенерационный остео- и ангиогенез является взаимосвязанным процессом, молекулярные механизмы регуляции которого изучены недостаточно. В связи с этим целью настоящей работы является исследование межклеточных молекулярных механизмов репаративной регенерации костной ткани при её травматическом повреждении с позиции современной концепции о регенерационном гистогенезе. Материал и методы. Материал исследования составили параоссальные гематомы, полученные от 12 пациентов в возрасте от 15 до 84 лет (из них 4 - мужчины) с переломами костей верхней конечности (табл. 1). Материал получен в процессе реконструктивного хирургического вмешательства в условиях травматологического отделения НУЗ «Дорожная клиническая больница» им. Н. А. Семашко на 1-, 3-8-, 10-е и 12-е сутки после травмы. Пациенты были информированы о целях и задачах исследования, потенциальной пользе от участия и возможных рисках, связанных с предоставлением биологического материала. Все пациенты подписывали добровольное информированное согласие. Регистрационный номер исследования в международном регистре ClinicalTrials.gov: NCT03244969. Образцы гематом фиксировали в 10 % забуференном формалине, декальцинировали в Биодек R (Биовитрум, Россия) и заливали в парафин по стандартной методике. Препараты толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, трёхкомпонентным красителем для элективного выявления соединительной ткани по Маллори, а также импрегнировали серебром по Футу с целью выявления ретикулярных (аргирофильных) волокон. Для селективной оценки различных молекулярных механизмов межклеточных взаимодействий применяли антитела к эндотелиальному сосудистому фактору роста - Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), рецептору эндотелиального сосудистого фактора роста 1-го типа - Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1 (VEGFR1, или Flt-1), рецептору эндотелиального сосудистого фактора роста 2-го типа - Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 (VEGFR2, или KDR/Flk-1), рецептору эндотелиального сосудистого фактора роста 3-го типа - Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-3 (VEGFR3, или Flt-4), альфа-гладкомышечному актину - α-smooth muscle actin (α-SMA), подопланину, нейрофиламентам, CD31, CD163, а также PCNA. Характеристика используемых антител приведена в табл. 2. С целью количественной оценки различных компонентов репаративной регенерации выполняли расчёт морфометрических показателей, в том числе: площадь соединительной ткани (%), индекс пролиферации (ИП), индекс VEGF-положительных клеток (%), индекс экспрессии Flt-1 (VEGFR1), индекс экспрессии Flk-1 (VEGFR2), индекс экспрессии Flt-4 (VEGFR3). Изображения для морфометрии были выполнены на микроскопе Zeiss Axio Imager Z2 (Zeiss AG, Германия) с видеокамерой и программным обеспечением AxioVision. Для анализа изображений применяли программу ImageJ, National Institutes of Health (США). Математическая обработка включала вычисление средней величины каждого показателя и стандартного отклонения. Результаты исследования. В посттравматической регенерации костной ткани принято выделять три фазы: ранних посттравматических изменений, регенерации и функциональной адаптации. Исследованный материал позволил проанализировать гистогенетические процессы в первую фазу и в начале второй. Фаза ранних посттравматических изменений (1-4-е сутки). В 1-е сутки после перелома на препаратах параоссальной гематомы определяются фибрин и скопления эритроцитов, среди которых встречаются единичные макрофаги, а также отдельные сегментоядерные лейкоциты. В область повреждения наблюдается миграция гетерогенной популяции макрофагов. К 4-м суткам среди массивных пучков нитей фибрина и множества гибнущих эритроцитов отмечается нарастание числа макрофагов с 0,6±0,1 до 5,2±2,1, которые становятся ведущим клеточным диффероном на этом сроке. В цитоплазме части из них отчётливо видны фагоцитированные фрагменты эритроцитов. В 91 % клеток макрофагального дифферона определяется цитоплазматическая реакция с антителами к VEGF различной степени выраженности, что свидетельствует об активной цитокин-синтетической функции клеток. Экспрессия рецепторов Flt-1 и Flt-4 отмечается на мембране 70,5 и 69,4 % клеточных элементов регенерата соответственно. Формирование к 4-м суткам в гематоме локального пула клеток-продуцентов VEGF предшествует появлению среди тканевого детрита первых тонкостенных сосудов со средним диаметром 11,7±3,5 мкм, число которых составляет 4,4±0,6. Сосуды располагаются неравномерно, преимущественно одиночно, в отдельных полях зрения - плотно друг к другу по 3-4 капилляра, что может быть проявлением расщепления. В этом случае новые капилляры образуются вследствие формирования перегородки в исходном сосуде с последующим его раздвоением. Стенка большинства сосудов представлена одним слоем эндотелиоцитов, расположенных на базальной мембране. В 83 % из них в составе стенки имеются α-SMA-положительные клеточные элементы. Возможно, ими являются перициты, обеспечивающие стабилизацию структуры новообразованного сосуда. Появление первых сосудов коррелирует с высокой митотической активностью эндотелиоцитов, ИП которых составляет 77,5 %, что является проявлением интенсивного ангиогенеза. Отмечается высокая плотность рецепторного поля VEGF - экспрессия Flt-1 и Flk-1 определяется в 84,5 % и 86,9 % клеток эндотелиального дифферона соответственно, что отражает тесное межклеточное молекулярное взаимодействие с цитокин-продуцирующими макрофагами. В части клеток определяется ядерная локализация Flt-4, что может являться следствием процесса интернализации, при котором рецептор после связывания с лигандом путём эндоцитоза доставляется внутрь ядра и выполняет в нём роль транскрипционного фактора, обеспечивающего регуляцию собственной экспрессии и других ангиогенных цитокинов. На 4-е сутки преимущественно в перикапиллярном пространстве определяются немногочисленные клетки фибробластического дифферона, а также овальные одноядерные клетки, богатые слабооксифильной цитоплазмой. ИП в перикапиллярных зонах составляет 66,6 %, что свидетельствует об активном митотическом процессе клеточных элементов, мигрирующих в зону повреждения из новообразованных капилляров. Среди клеток фибробластического дифферона отмечается умеренная неоднородность уровня экспрессии рецепторов к VEGF: антитела к Flk-1 маркируют 52 % клеточных элементов. Также отмечается формирование небольших фокусов незрелой соединительной ткани, представленной молодыми аргирофильными волокнами, что отражает начало процесса формирования соединительнотканного матрикса. Таким образом, в ходе первых 4 сут наблюдаются изменение клеточно-дифферонной организации регенерата, формирование регенерационного макрофагально-фибробласто-эндотелиального регенерационного гистиона, морфофункциональное становление которого происходит при участии VEGF-VEGFR-регуляторной оси (рисунок). Фаза регенерации. Период активного ангиогенеза и формирования соединительнотканного матрикса (4-10-е сутки). К 5-7-м суткам количество клеточного детрита заметно уменьшается. В центральных зонах гематомы встречаются лишь островки лизированных эритроцитов и нитей фибрина, что сопровождается нарастанием числа клеток макрофагального дифферона до 7,2±3,4 к 6-м суткам. Доля VEGF-положительных клеток к 10-м суткам уменьшается с 91 до 73 %, что, по-видимому, отражает снижение активности цитокин-синтетической функции и смену популяционного состава макрофагов. К 7-м суткам плотность сосудов в гематоме увеличивается в 2,5 раза и достигает 11,4±0,9, а их диаметр - 8,2±2,3 мкм. Стабильно высокий ИП эндотелиоцитов остаётся в интервале от 77,5 до 88,5 %. Антитела к Flk-1 и Flt-4 маркируют 86 и 74 % клеток соответственно, что отражает высокую плотность рецепторного поля клеток эндотелиального дифферона и обеспечивает реализацию сигнала VEGF. Таким образом, в период с 5-х до 10-х суток определяется наибольшая активность ангиогенеза. В мембране эндотелиоцитов единичных тонкостенных сосудов на 6-е сутки отмечается умеренно интенсивная экспрессия подопланина, что свидетельствует о формировании в посттравматической гематоме немногочисленных лимфатических сосудов диаметром до 76 мкм, что отражает процесс лимфангиогенеза. Активный процесс ангиогенеза происходит параллельно с увеличением объёма соединительной ткани разной степени зрелости, к 6-м суткам составляющего 63,8 %. Клетки фибробластического дифферона распределены относительно равномерно по всей площади препарата, что может являться проявлением активного процесса их миграции из перикапиллярной зоны. Их ИП в этом периоде увеличивается и к 10-м суткам составляет 74 %, что в корреляции с мембранной экспрессией 89 % клеток Flk-1 определяет важную роль VEGF-VEGFR-регуляторной оси в формировании зрелого соединительнотканного матрикса. Плотный каркас коллагеновых волокон, по-видимому, обеспечивает оптимальные условия для нейрогенеза: на 8-е сутки отмечается прорастание первых нервных волокон диаметром до 68 мкм. Период раннего остеогистогенеза (10-12- е сутки). К 10-м суткам весь объём параоссальной гематомы представлен соединительной тканью разной степени зрелости, доля которой составляет 80,3. Реактивно изменённая соединительная ткань становится более дифференцированной, фибробласты активно синтезируют коллаген, коллагеновые волокна объединяются в пучки различной ориентации, фибробласты дифференцируются в фиброциты. Снижение к 12-м суткам ИП фибробластов до 54 % отражает преобладание дифференцировки над пролиферацией. Экспрессия Flk-1 и Flt-4 составляет 80 и 82 % соответственно, что свидетельствует о значимой роли VEGF не только в процессе пролиферации клеток фибробластического дифферона, но и в процессе их дифференцировки. К 12-м суткам общее число сосудов снижается с 11,4±0,9 до 4,5±0,5, из которых 73 % содержат в стенке α-SMA-положительные клетки. Снижение митотической активности эндотелиоцитов до 57 % коррелирует со снижением Flk-1-позитивных клеток на 15 %. Также уменьшается число клеток макрофагального дифферона с 7,2±3,4 до 2,1±1,1, из которых 74 % положительно маркируются антителами к VEGF. Число сосудов, достигнув максимума на 7-8-е сутки, начинает снижаться, что обусловлено гибелью клеточных элементов части капилляров путём апоптоза. На 10-12-е сутки в параоссальной гематоме формируются структуры грубоволокнистой костной ткани, внутри и по периметру которых залегают дифференцирующиеся остеобласты. Синтезируя коллагеновую основу межклеточного вещества, остеобласты образуют тонкие ажурные трабекулы и по мере увеличения объёма сами включаются в их структуру, приобретая черты остеоцитарной дифференцировки. Антитела к PCNA маркируют ядра 30 % клеток остеобластического дифферона, которые располагаются преимущественно по периферии структур грубоволокнистой костной ткани, что отражает их снижающуюся митотическую активность. Наличие экспрессии Flt-1и Flk-4 у более чем 90 % клеток остеобластического дифферона подтверждает роль VEGF-VEGFR-регуляторной оси в процессах их гистогенеза. Положительное маркирование части остеобластов антителами к α-SMA отражает наличие сократительного аппарата, который обеспечивает их миграцию в соединительнотканном матриксе. Обсуждение полученных данных. Формирование параоссальной гематомы является самым ранним этапом репаративного остеогистогенеза. В эксперименте показано, что уже на 4-е сутки после перелома параоссальная гематома обладает остеогенным потенциалом [11]. Процессы репаративного остеогенеза в гематоме начинаются сразу после её формирования, а удаление гематомы на 2-еи 4-е сутки после перелома сопровождается увеличением продолжительности заживления [7]. Одним из ранних событий остеорепарации является миграция в область повреждения популяции макрофагов, большая часть которых экспрессируют VEGF. Наибольший уровень экспрессии ангиогенных факторов роста обеспечивают M1-макрофаги, относящиеся к провоспалительной фракции, в то время как M2с-макрофаги обеспечивают продукцию MMP9 - белка, который играет важную роль в процессе ремоделирования экстрацеллюлярного матрикса на этапе «созревания» грануляционной ткани [13]. Как и в кожной ране, репаративный остеогистогенез сопровождается последовательной сменой популяционного состава макрофагов - M1-макрофаги, преобладающие на ранних этапах, постепенно сменяются популяцией M2-макрофагов, которые синтезируют антивоспалительные цитокины, такие как IL-10. Наличие экспрессии Flk-1 на мембране большей части клеток макрофагального дифферона, по нашим данным, также подтверждает гипотезу о том, что действие цитокина осуществляется по принципу ауто-и паракринной регуляции с участием VEGF-VEGFR-регуляторной оси. Нарушение кровоснабжения области повреждения является одним из основных лимитирующих факторов восстановления целостности костной ткани. В эксперименте было показано, что введение в область репаративной регенерации VEGF индуцирует ангиогенез и сокращает сроки формирования костной мозоли [12]. Нами установлено, что экспрессия рецепторов VEGF имеется не только на мембране подавляющей части эндотелиоцитов, но и у других видов клеток, включая остеобласты. Таким образом, полученные результаты анализа посттравматического остеогистогенеза в параоссальных гематомах у человека создают предпосылки к разработке новых средств оптимизации репаративной регенерации костной ткани [5, 10]. С помощью антител к подопланину нам удалось селективно выделить единичные лимфатические сосуды в составе параоссальной гематомы, источником которых могут являться лимфатические сосуды периоста. Их направленный рост в область повреждения может обеспечиваться высокой локальной концентрацией VEGF, который реализует свой сигнальный путь при взаимодействии с рецептором VEGFR2 [8]. Исследования последних 10-15 лет показали, что кость является хорошо иннервируемым органом - процессы резорбции и остеогенеза регулируются рядом биологически активных пептидов [6]. В настоящей работе применение антител к нейрофиламентам позволило продемонстрировать появление первых нервных волокон в составе гематомы уже на 8-е сутки, что интересно в связи с данными о том, что VEGF индуцирует пролиферацию шванновских клеток, рост нейритов и является важным регулятором регенерации периферических нервов [9]. Таким образом, на ранних стадиях репаративного остеогенеза одним из ключевых компонентов регуляции является регуляторная ось VEGF-VEGFR. Межклеточные молекулярные взаимодействия в рамках этой регуляторной оси обеспечивают последовательную смену клеточнотканевых дифферонов в параоссальной гематоме и контролируют такие компоненты гистогенеза, как миграция, пролиферация и дифференцировка клеточных элементов. Понимание значимой роли VEGF-VEGFR-регуляторной оси может быть использовано для разработки новых таргетных препаратов, направленных на коррекцию репаративного остеогистогенеза и остеопластических материалов, которые обладали бы хорошей остеоиндуктивностью и были бы максимально приближены к понятию «идеальный» костнозамещающий материал. Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ мол_а № 16-34-00440. Работа поддержана программой повышения конкурентоспособности Казанского (Приволжского) федерального университета и субсидиями, выделенными Казанским (Приволжским) федеральным университетом по государственному заданию в сфере научной деятельности. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: Р. В. Д. Сбор и обработка материала: М. О. М. Статистическая обработка данных: М. О. М. Анализ и интерпретация данных: И. Л. П., И. Я. Б., М. С. А. Написание текста: И. Л.П. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

About the authors

R. V. Deyev

I. P. Pavlov Ryazan State Medical University

Email: romdey@gmail.com
Department of Pathology with Forensic Medicine Course

I. L. Plaksa

Moscow City Oncology Hospital No 62

Email: i.plaksa2014@yandex.ru
Department of Pathology

M. O. Mavlikeyev

Kazan’ Federal University

Email: mmavlikeev@gmail.com
Department of Morphology and General Pathology

I. Ya. Bozo

A. I. Yevdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry

Email: ilya-bozo-1989@yandex.ru
Department of Maxillofacial Surgery

M. S. Abyzova

Kazan’ Federal University

Department of Morphology and General Pathology

References

Supplementary files