CHANGES OF H3 HISTONE ACETYLATION IN THE HIPPOCAMPUS OF RATS RESULTING FROM SEVERE HYPOBARIC HYPOXIA AND THE ROLE OF HYPOXIC POSTCONDITIONING

Full Text

В последние десятилетия в мире интенсивно проводится изучение механизмов повышения толерантности мозга к повреждающим факторам (прежде всего, к гипоксии/ишемии), а также осуществляется поиск немедикаментозных способов ее обеспечения, в частности, с использованием прекондиционирующих гипоксических/ишемических воздействий [5]. Влияние умеренной гипоксии или ишемии способствует активации адаптивных, приобретенных эволюционно и генетически детерминированных эндогенных механизмов, направленных на предотвращение структурно-функциональных повреждений мозга, вызываемых тяжелыми, в том числе летальными, формами гипоксии/ишемии [3]. В последние годы обнаружен также протективный эффект посткондиционирующих воздействий, предъявляемых вслед за эпизодами тяжелой ишемии мозга или психоэмоционального и травматического стресса [6, 13]. Убедительно показано, что трехкратная умеренная гипобарическая гипоксия в режиме посткондиционирования нивелирует нарушения функций мозга, вызываемые тяжелыми гипоксическими воздействиями [13]. Многочисленные исследования показали, что в основе нарушений поведения и способности к обучению при действии тяжелой гипоксии/ишемии лежат изменения функционирования мозга на молекулярно-клеточном уровне. В последние годы обнаружено вовлечение эпигенетической регуляции в обеспечение реакций клеток мозга на гипоксию [7-9, 11, 12]. Однако до сих пор не проводились исследования влияния адаптогенной умеренной гипобарической гипоксии в режиме посткондиционирования на модификации эпигенетического статуса в ответ на тяжелые повреждающие воздействия. В настоящей работе с применением иммуногистохимических методов проведено изучение влияния тяжелой гипобарической гипоксии и посткондиционирования, эффективно повышающего устойчивость мозга, на модификацию эпигенетических факторов, а именно ацетилирование гистонов Н3 по лизину 9. Материал и методы. Работа проведена на животных из ЦКП Биоколлекция ИФ РАН, поддержана Программой ФАНО России по сохранению и развитию биоресурсных коллекций. Эксперименты выполняли на самцах крыс линии Вистар (n=84) в возрасте 80-90 дней с массой тела 230-260 г. При проведении экспериментов соблюдались требования, сформулированные в Директивах Совета Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) об использовании животных для экспериментальных исследований. Протоколы опытов были утверждены Комиссией по гуманному обращению с животными ФГБУН «Институт физиологии им. И. П. Павлова» РАН. Для создания условий тяжелой повреждающей гипоксии (ТГ) крыс помещали в барокамеру проточного типа при температуре от 20 до 25 ºС и ступенчато понижали давление до 180 мм рт. ст. (5 % О2, продолжительность воздействия - 3 ч). Смертность животных в барокамере составляла 50 % [4]. Посткондиционирование (ПостК) осуществляли путем одно-, двух-или трехкратного 2-часового воздействия умеренной гипобарической гипоксии (УГГ) (давление в барокамере 360 мм рт. ст., 10 % О2). Воздействия УГГ осуществляли через 24 ч после ТГ с суточными интервалами между сеансами. В течение всего периода проведения экспериментов крысы содержались при режиме свет 12 ч/темнота 12 ч, температуре 20-23 ºС и при постоянном доступе к воде и пище. Декапитацию животных проводили через 2, 3 и 4 сут после ТГ и, соответственно, через 1 сут после одного, двух или трех сеансов УГГ, предъявляемых через 24 ч после воздействия ТГ (ТГ+1, 2 или 3ПостК+1 день). Параллельно осуществляли выведение из эксперимента декапитацией крыс контрольной группы. Число крыс для каждой группы составило 6 особей. После декапитации вскрывали череп, извлекали мозг, отрезали мозжечок и помещали мозг в фиксирующий раствор. Образцы ткани мозга обрабатывали согласно стандартному гистологическому протоколу: фиксировали в молекулярном фиксаторе FineFix (Milestone, Италия) в разведении 28 мл фиксатора+72 мл 96 º этанола в течение 24 ч при t=4 ºC. Затем образцы обезвоживали в этаноле возрастающих концентраций, оставляли в бутаноле, проводили через 2 порции ксилола (по 30-40 мин) и заливали в парафин. На ротационном микротоме (Reichert, Австрия) изготавливали серийные срезы мозга во фронтальной плоскости толщиной 7 мкм. Полученные срезы монтировали на предметные стекла, обработанные полилизином, депарафинизировали в ксилоле (2 смены по 5 мин) и подвергали регидратации в спиртах понижающихся концентраций. Для оценки степени ацетилирования гистона Н3 по Lys9 (acH3K9) и определения общего ацетилирования (pan-acetyl, ПА) использовали иммуногистохимическую методику. Основные этапы метода: 1) инкубация с поликлональными кроличьими антителами к acH3K9 (SAB4500347, Sigma Ald., США, разведение в PBS 1:200) или pan-acetyl [(C4)-R: sc-8663-R, Santa Cruz Biotechnology, Inc., США, разведение в PBS 1:500]; 2) инкубация с вторичными противокроличьими биотинилированными антителами (Vectastein ABC kit, Vector Laboratories, Inc., США, разведение в PBS 1:200); 3) инкубация с комплексом авидина и биотинилированной пероксидазы (ABC, Vector Laboratories, Inc., США, разведение реагентов А и В 1:100); 4) визуализация реакции с помощью диаминобензидинового кита. Анализ препаратов проводили с помощью морфометрической установки, состоящей из светового микроскопа Jenaval (Carl Zeiss, Германия), цифровой камеры Baumer CX05c (Baumer Optronic, Германия) и компьютера IBM PC с программным обеспечением ВидеоТест Мастер Морфология (ВидеоТест, Россия). Подсчитывали нейроны пирамидного слоя СА1 поля гиппокампа в поле зрения площадью 460×340 мкм (об. 40). На основании оценки оптической плотности иммунопозитивные клетки разделяли на 2 класса: слабо и интенсивно окрашенные, анализировали общее число иммунопозитивных и число интенсивно окрашенных клеток. Для каждого животного анализировали по 4 гистологических среза, усредняя значения для каждой области мозга c одного поля зрения конкретной области мозга на срезе. Результаты обрабатывали с помощью пакетов анализа данных Statistica 7.0 Stat Soft Inc. и Microsoft Excel 2003. О значимости различий судили по непараметрическому критерию Манна-Уитни (Mann-Whitney U-test). Изменения считали значимыми при p≤0,05. Все результаты представлены в виде среднего арифметического значения изучаемого параметра, выраженного в процентах от контроля, и его стандартной ошибки. Результаты исследования. В работе оценивали общий статус ацетилирования клеток гиппокампа по анализу уровня иммунопозитивности к ПА, позволяющему выявить все имеющиеся в клеточных белках ацетилированные остатки лизина. На рис. 1 представлены репрезентативные микрофотографии иммунопозитивных к ПА клеток в поле СА1 гиппокампа контрольных крыс и крыс, подвергавшихся воздействию ТГ без или с последующим предъявлением одно-, двух-или трехкратной УГГ в режиме ПостК. При подсчете иммунопозитивных к этому показателю клеток в СА1 поле гиппокампа крыс, переживших воздействие ТГ, значимых различий по сравнению с контролем не выявлено ни по общему числу (рис. 2, а), ни по числу интенсивно окрашенных клеток в течение всего исследованного срока (см. рис. 2, б). Предъявление сеансов ПостК вслед за ТГ приводило к стойкому увеличению как общего числа иммунопозитивных к ПА клеток (до 122 % по отношению к контролю), так и интенсивно окрашенных клеток, уже после первого предъявления УГГ. Эффект сохранялся после последующих сеансов УГГ (см. рис. 2, а, б). Наряду с этим, были выявлены особенности содержания одной из наиболее распространенных эпигенетических модификаций - ацетилированного по лизину 9 гистона Н3 (асН3К9) в клетках СА1 поля гиппокампа взрослых крыс после воздействия ТГ и ТГ с последующими сеансами УГГ (рис. 3). Тяжелая гипоксия не приводила к достоверному снижению общего числа иммунопозитивных клеток к acH3K9 в области СА1 гиппокампа (рис. 4, а). При этом количество интенсивно окрашенных клеток было незначительно снижено (до 20 %) в течение всего исследованного срока (см. рис. 4, б). Применение УГГ разной кратности вслед за ТГ вызывало увеличение как общего количества иммунопозитивных к acH3K9 (на 22-30 % от контроля), так и в значительной степени интенсивно окрашенных клеток (на 250-280 %) уже Обсуждение полученных данных. В проведенном исследовании выявлены особенности влияния ТГ и ее сочетанного действия с умеренной гипобарической гипоксией в режиме УГГ ПостК на ацетилирование гистона Н3 по лизину 9 в нейронах СА1 поля гиппокампа. Обнаружено, что ТГ на протяжении 4 сут после воздействия не приводит к значимому изменению уровня асН3К9. Его повышение у УГГ ПостК животных уже после первого сеанса согласуется с описанными нами ранее данными о достаточности даже одного сеанса УГГ ПостК для предотвращения процессов клеточной гибели, вызванных ТГ [13]. Сходная тенденция выявлена относительно изменений общего уровня ацетилирования ядерных белков в СА1 поля гиппокампа после воздействия ТГ и ТГ в сочетании с ПостК. Однако увеличение количества интенсивно окрашенных клеток к асН3К9 после предъявления умеренной гипоксии в режиме посткондиционирования выражено в большей степени, чем к ПА, что, очевидно, свидетельствует о преобладающем вкладе именно этой модификации в механизмы УГГ ПостК. Ранее в наших исследованиях было обнаружено снижение экспрессии ряда белков и соответствующих генов через 24 ч после действия ТГ, которое коррелировало с изменениями количества иммунопозитивных клеток к ацетилированию гистона Н3 по Lys24 (асН3К24) в гиппокампе и неокортексе крыс [10]. Различия в изменениях ацетилирования гистона Н3 по лизину 9 или 24 можно объяснить специфичностью функций разных форм ацетилирования Н3 в реакциях на повреждающие воздействия. Несмотря на отсутствие изменения ацетилирования асН3К9 в ответ на ТГ, применение УГГ ПостК уже после первого сеанса индуцирует увеличение данной модификации в области СА1 гиппокампа. Хорошо известно, что ацетилирование гистона Н3 приводит к релаксации хроматина, сопровождающейся повышением доступности регуляторных участков генов для транскрипционных факторов, что, в том числе, сопровождается стимуляцией экспрессии генов про-адаптивных белков Bcl-2, BDNF и эритропоэтина. Ранее нами было показано, что УГГ ПостК, улучшающее структурно-функциональную реабилитацию после тяжелого гипоксического воздействия, увеличивает экспрессию Bcl-2, BDNF [2], эритропоэтина, а также гипоксию индуцибельного фактора (HIF-1α) в нейронах поля СА1 гиппокампа крыс, переживших ТГ [1]. Таким образом, несмотря на то, что ТГ не влияет на уровень ацетилирования гистона Н3 по лизину 9, эта форма гистона Н3 активно включается в протективные процессы, обусловленные воздействием УГГ ПостК. Данные, полученные в настоящем исследовании, показывают, что процесс ацетилирования гистонов, в частности ацетилирования гистона H3, по-видимому, играет значительную роль в опосредовании нейропротективного эффекта гипоксического посткондиционирования. По всей видимости, это осуществляется посредством неспецифического облегчения активации основных проадаптивных генов. Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 17-0400624 и Программы РАН. Обработка результатов осуществлена с использованием технических возможностей ресурсного центра «Обсерватория экологической безопасности» научного парка Санкт-Петербургского государственного университета. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: Е. А. Р. Сбор и обработка материала: Т. С. Г., О. В. В. Статистическая обработка данных: О. В. В., К. В. С. Анализ и интерпретация данных: Е. И. Т., О. В. В. Написание и редактирование текста: Е. И. Т., О. В. В. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

About the authors

O. V. Vetrovoy

Russian Academy of Sciences I. P. Pavlov Institute of Physiology; St. Petersburg State University

Email: vov210292@yandex.ru
Laboratory of Regulation of Brain Neuron Function; Department of Biochemistry 6 Makarova Nab., St. Petersburg 199034; 7-9 Universitetskaya Nab., St. Petersburg 199034

T. S. Glushchenko

Russian Academy of Sciences I. P. Pavlov Institute of Physiology

Laboratory of Regulation of Brain Neuron Function 6 Makarova Nab., St. Petersburg 199034

K. V. Sariyeva

Russian Academy of Sciences I. P. Pavlov Institute of Physiology

Laboratory of Regulation of Brain Neuron Function 6 Makarova Nab., St. Petersburg 199034

Ye. I. Tyul’kova

Russian Academy of Sciences I. P. Pavlov Institute of Physiology

Laboratory of Regulation of Brain Neuron Function 6 Makarova Nab., St. Petersburg 199034

Ye. A. Rybnikova

Russian Academy of Sciences I. P. Pavlov Institute of Physiology

Laboratory of Regulation of Brain Neuron Function 6 Makarova Nab., St. Petersburg 199034

References

Supplementary files