RETINAL GANGLION CELL NUMBERS IN MICE WITH GENETIC DEFECT OF DIFFERENT SUBTYPES OF ALPHA-1-ADRENORECEPTORS

Full Text

Общепризнано, что гуморальная система организма оказывает существенное влияние на морфофункциональное состояние органов и тканей, в том числе и глаза [1, 4, 5, 9-11]. Доказана важная роль вегетативной нервной системы в сохранении функций зрительного анализатора (острота зрения, цветоощущение, поле зрения, стереоскопическое зрение и др.), например, у пациентов с первичной открытоугольной глаукомой (ПОУГ) [6, 7, 11]. Кроме того, чувствительность тканей глаза к трофическим нервным влияниям подтверждена экспрессией в них адренергических рецепторов [16, 19]. Описана роль альфа-1-адренорецепторов в регуляции ряда физиологических процессов, связанных с функционированием нервной системы (например, модуляцией синаптической пластичности) [21], контролем кровяного и внутриглазного давления, спазмом артериол, снижением проницаемости сосудистой стенки, сужением зрачка, регуляцией гемодинамики глаза, циркадианных ритмов внутриглазного давления и др. [13, 14]. Такие современные антиглаукомные препараты, как селективные агонисты альфа-адренорецепторов, доказавшие свою эффективность, к сожалению, демонстрируют ее лишь на ранних этапах формирования ПОУГ, что, возможно, связано с постепенной утратой чувствительности тканей глаза к симпатическим влияниям [1]. Однако до настоящего времени не изучено селективное влияние отдельных подтипов альфа-1-адренорецепторов на анатомо-топографические особенности сетчатки, что важно при изучении роли нервной трофики зрительного анализатора. Это особенно актуально в связи с известным фактом гибели примерно 25 % ганглиозных клеток сетчатки к моменту формирования I стадии ПОУГ [15, 20]. Интерес представляет также модулирующая активность супрахиазматического ядра гипоталамуса в части симпатической и парасимпатической иннервации глаза, продукции камерной влаги глазного яблока и ее оттока [11, 16, 17]. Целью настоящего исследования явилось проведение сравнительного изучения количества ганглиозных клеток сетчатки у мышей с генетическим дефектом различных подтипов альфа-1адренорецепторов. Материал и методы. Исследование выполнено в период с 10 ноября 2015 г. по 10 января 2016 г. на 36 лабораторных мышах мужского пола (экспериментальная группа) в возрасте от 1 года 6 мес до 1 года 11 мес, имеющих генетический дефект по одному из трех следующих подтипов альфа-1-адренорецепторов: альфа-1a (15 мышей), альфа-1b (11 мышей) и альфа-1d (10 мышей). Все изученные линии лабораторных мышей - ADRA-1A, ADRA-1B и ADRA- 1D - предоставлены Университетом им. Гутенберга (г. Майнц, Германия) в рамках поддержанного грантом научного исследования. Группа контроля сформирована из 10 интактных лабораторных мышей (линия C57Bl/6NTac) такого же возраста и пола. Все животные контрольной и экспериментальной группы с момента рождения содержались в виварии в стандартных условиях пищевого рациона, освещенности, температуры и влажности воздуха, количества животных в клетке: свободный доступ к пище и еде, 12-часовой свето-темновой цикл искусственного освещения, температура воздуха 22±2 ºС, влажность воздуха 55±10 %, по 4 мыши в клетке. Исследование выполнено только на правом глазу, так как среди включенных в исследование экспериментальных животных линии ADRA-1D зарегистрировано 3 случая повреждения левого глазного яблока другими содержащимися совместно животными этой же линии по причине их выраженного агрессивного поведения. Применяли стандартный протокол иммунофлюоресцентного метода дифференцированной визуализации клеток сетчатки с помощью Brn3a-маркера (Santa Crus Biotechnology, Германия), являющего ядерным белком и эндогенным маркером ганглиозных клеток сетчатки. Энуклеация изучаемого глазного яблока выполнена сразу после выведения мыши из эксперимента ингаляцией углекислого газа, после чего энуклеированное глазное яблоко помещали в раствор 4 % формальдегида (Sigma, Германия) на 30 мин при комнатной температуре с последующим отмыванием его в натрийфосфатном буфере (PBS-раствор, Invitrogen, Германия) и изготовлением тотального плоскостного препарата сетчатки с четырьмя надрезами ее периферического отдела на 3, 6, 9 и 12 ч (рис. 1). Препарат сетчатки перемещали в эппендорф внутренней (витреальной) поверхностью вверх, отмывали с помощью PBS-раствора с добавлением 0,5 % раствора Triton X-100 дважды по 10 мин при комнатной температуре и замораживали в растворе PBS с добавлением 0,5 % раствора Triton X-100 при температуре -70 ºС в течение 15 мин. Затем препарат сетчатки оставляли при комнатной температуре для оттаивания, отмывали PBS-раствором с добавлением 0,5 % раствора Triton X-100 дважды по 10 мин. Инкубацию препарата сетчатки с первичными антителами, разведенными в соотношении 1:750 (стерильный PBS-раствор, 2 % раствор Triton X-100, Brn3a-антитела, 2 % раствор Normal Donkey Serum, Santa Crus Biotechnology, Германия), производили в течение 2 ч при комнатной температуре и в течение ночи при температуре +4 ºС. Далее препарат сетчатки отмывали PBS-раствором с добавлением 2 % раствора Triton X-100 при комнатной температуре в течение 5 мин и еще 4 раза по 10 мин PBS-раствором с добавлением 0,5 % раствора Triton X-100. Инкубацию препарата сетчатки с вторичными антителами, разведенными в соотношении 1:500 (стерильный PBS-раствор, 2 % раствор Triton X-100, раствор Alexafluo-568, Invitrogen, Германия), производили в течение 2 ч при комнатной температуре, отмывали PBS-раствором с добавлением 2 % раствора Triton X-100 в течение 5 мин и еще 4 раза по 10 мин PBS-раствором с добавлением 0,5 % раствора Triton X-100, перемещали на предметное стекло и после нанесения 1 капли DAPI-хромогена (4’,6’-diamino2-phenylindole - универсальный ядерный краситель, испускающий синюю флюоресценцию в области ДНК клетки) (Sigma, Германия) защищали покровным стеклом. Готовые препараты сетчатки изучали с помощью микроскопа MX51 (Olympus, Германия) в 16 полях зрения (об. 40) по схеме зон наблюдения и подсчета (см. рис. 1). Подсчет среднего общего числа клеток сетчатки осуществляли, подсчитывая число клеточных ядер, визуализированных с помощью DAPI-фильтра, в указанных зонах наблюдения; при этом подсчет среднего числа ганглиозных клеток сетчатки (ГКС) осуществляли по числу клеточных ядер, визуализированных с помощью TRITC-фильтра в тех же изученных 16 зонах наблюдения [17, 23]. Статистическую обработку данных производили с использованием программы Statistica 6.0 для вычисления среднего числа изучаемых клеток в поле зрения и его стандартной ошибки. Оценка значимости различий между средними величинами числа клеток сетчатки для каждой изученной линии животных произведена с использованием t-критерия Стьюдента. Работа в лаборатории осуществлена в соответствии с принципами Хельсинкской Декларации Всемирной медицинской ассоциации и «Принципами надлежащей лабораторной практики» (национальный стандарт РФ ГОСТ Р 53434-2009). Результаты исследования. С помощью методов дифференцированной визуализации клеток сетчатки, позволяющих производить их подсчет, впервые обнаружены особенности их количественных характеристик для каждой изученной линии мышей-самцов (C57Bl/6NTac, ADRA-1A, ADRA-1B и ADRA-1D) в возрасте от 1 года 6 мес до 1 года 11 мес. Установлено, что в группе контрольных мышей линии C57Bl/6NTac общее число клеток сетчатки составляет в среднем 248,3±6,41 клеток в поле зрения (кл./п.зр.) (рис. 2). В группе экспериментальных нокаутных мышей линии ADRA- 1A, ADRA-1B и ADRA- 1D общее число клеток сетчатки имеет максимально приближенные значения: 249,8±1,21, 248,62±8,22 и 246,5±9,88 кл./п.зр. соответственно (таблица). Методом специфического выявления ганглиозных клеток сетчатки (ГКС) обнаружено, что их число в группе контрольных и экспериментальных нокаутных мышей различается. Для сетчатки у мышей линии C57Bl/6NTac их значение в среднем составляет 107,23±2,69 кл./п.зр. (рис. 3). При этом для сетчатки у мышей с генетическим дефектом одного из подтипов альфа-1-адренорецепторов (линии ADRA-1A, ADRA-1B и ADRA-1D) в среднем характерно следующее число ГКС: 95,8±0,12, 116,45±7,29 и 112,55±4,47 кл./п.зр. соответственно (р<0,05). Кроме того, процентное соотношение ГКС к общему числу клеток сетчатки во всех изученных линиях мышей также различно. Например, ГКС в поле зрения сетчатки мышей линии C57Bl/6NTac составляет в среднем 43,19±0,64 %. При этом характерные для сетчатки мышей с генетическим дефектом одного из подтипов альфа-1-адренорецепторов (линии ADRA-1A, ADRA-1B и ADRA-1D) относительное содержание ГКС составляет 38,34±0,64, 46,68±1,76 и 45,71±1,14 % соответственно. Обсуждение полученных данных. Анализ полученных результатов показал, что сетчатка у мышей линии ADRA-1A имеет наименьшее, а сетчатка у мышей линии ADRA-1B - наибольшее число ГКС в сравнении с другими изученными линиями. Данный результат важно рассматривать в неразрывной связи с другими ранее проведенными исследованиями тех же линий экспериментальных животных [7, 8, 12], позволившими установить, что для мышей с генетическим дефектом одного из подтипов альфа- 1-адренорецепторов характерен более высокий уровень внутриглазного давления (ВГД), чем у интактных. При этом максимально выраженные суточные колебания ВГД выявлены именно у мышей линии ADRA-1A. Это создает условия для выраженной нестабильности гидро- и гемодинамики глаза, прежде всего в области головки зрительного нерва, инициирует нарушение трофики зрительного нерва и сетчатки, реперфузионное повреждение их ткани и гибель ганглиозных клеток сетчатки [15, 20]. Эти повреждения более выражены именно при максимальном перепаде ВГД [12, 20]. Представленные в данной статье результаты способствуют уточнению механизмов нарушения ауторегуляции глазного кровотока и офтальмотонуса при анализе других ранее проведенных исследований [7, 12]. Важно отметить тот факт, что максимальный диапазон суточных колебаний ВГД, характерный для выраженной нестабильности гидродинамики глазного яблока, выявлен ранее у мышей линии ADRA-1A [8], демонстрирующих в настоящем исследовании наибольшие потери числа ГКС. Минимальный диапазон суточных колебаний ВГД, характерный для относительно стабильной гидродинамики глаза, наблюдается у представителей линии ADRA-1B [8], для которых в настоящем исследовании характерна максимальная сохранность числа ГКС. Повышенное ВГД является одним из ключевых факторов патогенеза глаукомы. Известно, что у большинства пациентов с ПОУГ повышенное ВГД регистрируется утром [3, 12, 18], когда осуществляется ритмичная смена функциональной активности отделов вегетативной нервной системы организма [2, 22]. Следствием этого является практическая рекомендация пациенту по коррекции его образа жизни - ранний утренний подъем. Это позволяет, корректируя преобладание парасимпатических эффектов, снизить повреждающее воздействие высокого ВГД на головку зрительного нерва в условиях пониженного артериального давления в утренние часы, характерного для пациентов с ПОУГ [7, 12, 18]. Кроме того, доказано, что в ответ на повышение ВГД рефлекторно возникает сужение интраокулярных артерий (сосудистый рефлекс Кальфа), искажение которого в условиях дисбаланса вегетативной нервной системы, например, при генетическом дефекте подтипов адренорецепторов, может иметь большое значение в патогенезе ПОУГ. Учитывая неодинаковую роль различных подтипов альфа-1-адренорецепторов в регуляции гидро-, гемодинамики глаза, кровяного давления, а следовательно, в возникновении условий для реперфузионного повреждения тканей глаза и прогрессирования глаукомы, необходимо дальнейшее изучение особенностей кровяного и перфузионного внутриглазного давления у мышей с названными генетическими дефектами. Проведенное сравнительное исследование позволило обнаружить количественные различия ГКС у старых интактных мышей линии C57Bl/6NTac и мышей с генетическим дефектом одного из подтипов альфа-1-адренорецепторов и сформулировать следующие выводы: 1) сетчатка у мышей линии ADRA-1A имеет наименьшее число ГКС (95,8±0,12 кл./п.зр.) в сравнении с линиями мышей C57Bl/6NTac, ADRA- 1B и ADRA- 1D (107,23±2,69, 116,45±7,29 и 112,55±4,47 кл./п.зр. соответственно); 2) сетчатка у мышей линии ADRA-1B имеет наибольшее число ГКС (116,45±7,29 кл./п.зр.) в сравнении с линиями мышей C57Bl/6NTac, ADRA- 1A и ADRA-1D (107,23±2,69, 95,8±0,12 RGC и 112,55±4,47 кл./п.зр. соответственно); 3) общее число клеток сетчатки у мышей линии C57Bl/6NTac (248,3±6,41 кл./п.зр.) и мышей с изученными генетическими дефектами линии ADRA-1A, ADRA-1B, ADRA-1D (249,8±1,21, 248,62±8,22, 246,5±9,88 кл./п.зр. соответственно) сходно. Полученные данные свидетельствуют о необходимости выделения мышей линии ADRA-1A в качестве модели изучения патоморфологических и патофизиологических изменений в тканях глаза при формировании ПОУГ. Кроме того, полученные результаты свидетельствуют о специфическом вкладе альфа-1a-, альфа-1b-и альфа1d-подтипов адренорецепторов в процесс формирования анатомо-топографических особенностей сетчатки. Работа выполнена при поддержке гранта Германской службы академических обменов (DAAD) и Министерства образования и науки Российской Федерации, в рамках программы академического обмена на тему «Фундаментальная офтальмология: роль симпатической нервной системы в патогенезе первичной открытоугольной глаукомы» (соглашение с исследователем № 91578056). Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: Н. В. К. Сбор и обработка материала: Н. В. К. Статистическая обработка данных: Н. В. К. Анализ и интерпретация данных: Н. В. К. Написание текста: Н. В. К. Автор сообщает об отсутствии в статье конфликта интересов.

About the authors

N. V. Korsakova

I. N. Uliyanov Chuvash State University; S. N. Fyodorov Eye Microsurgery Federal State Center

Email: korsnv@rambler.ru
Department of Ophthalmology and Otolaryngology; Cheboksary Branch 15 Moskovskiy prospekt, Cheboksary 428000; 10 Prospekt Traktorostroiteley, Cheboksary 428028

References

Supplementary files