ANALYSIS OF MICRONUCLEI FREQUENCY IN EPITHELIAL CELLS AND LYMPHOCYTES AND ITS CORRELATION WITH GLUTATHIONE-S-TRANSFERASE GENE POLYMORPHISM IN PATIENTS WITH TICK-BORNE ENCEPHALITIS

Full Text

Нами впервые было установлено, что вирус клещевого энцефалита (КЭ) в условиях in vitro, а также у больных людей in vivo способен индуцировать значительное увеличение числа Т-лимфоцитов с аберрациями в числе и структуре хромосом [4, 8]. Известно, что в результате иммунного ответа при различных инфекционных заболеваниях, включая КЭ, клетки иммунной системы активно продуцируют реактивные формы кислорода и азота, которые могут повреждать ДНК и индуцировать генные и хромосомные мутации [2, 12]. Поэтому можно предположить, что повышение частоты цитогенетических нарушений у больных КЭ связано с оксидативным стрессом, который приводит к повреждению хромосом в различных соматических клетках. Однако анализ цитогенетических нарушений в других типах клеток, кроме иммунокомпетентных (например эпителиальных), у больных КЭ ещё не проводился. Глутатион-S-трансферазы способствуют защите организма от широкого круга химических соединений, включая реактивные формы кислорода и другие потенциальные мутагены. Имеются исследования, свидетельствующие о связи между тяжестью инфекционного заболевания и наличием у больного мутантных аллелей генов ферментов глутатион-S-трансфераз [7, 9]. Установлено, что носительство мутантных неактивных вариантов генов GSTM1 и GSTT1 часто сопровождается цитогенетической нестабильностью и повышенной чувствительность хромосомного аппарата человека к различным мутагенным факторам [9, 10]. Цель исследования заключалась в оценке изменений частоты лимфоцитов в периферической крови и клеток буккального эпителия с микроядрами у больных КЭ на протяжении острого и реконвалесцентного периодов болезни в зависимости от вариантов генов глутатион-Sтрансферазы (GSTM1 или GSTT1) в генотипе больного. Материал и методы. В исследование были включены 54 больных КЭ [возраст (38,3±4,3) года] и 35 здоровых лиц [возраст (36,9±3,7) года], сопоставимых по возрасту и полу, проживающих в г. Томске, а также в Томской и Тюменской областях. Их обследование проводилось с использованием рутинных клинико-лабораторных и цитогенетических методов - микроядерного анализа в клетках буккального эпителия и двухъядерных цитокинез-блокированных лимфоцитах в периферической крови [5]. Диагноз КЭ был поставлен на основании клинико-эпидемиологических данных, включающих сведения об укусах клещей, и подтвержден с помощью метода иммуноферментного анализа (ИФА) на антиген вируса КЭ, а также на иммуноглобулины классов M и G к этому вирусу (Вектор-Бест, Россия). С использованием ИФА иммуноглобулинов классов M и G к боррелиям иксодового клещевого боррелиоза (Вектор-Бест, Россия) у всех больных было исключено это заболевание. Обследование больных проводилось на базе клиники инфекционных болезней Сибирского государственного медицинского университета, а также на базах районных медицинских учреждений Томской и Тюменской областей. Исследование было одобрено этическим комитетом Сибирского государственного медицинского университета Минздрава РФ (протокол № 56 от 19.10.2015 г.), проводилось в соответствии с правилами «О порядке проведения биомедицинских исследований у человека» (2002 г.) и «Правилами клинической практики в РФ» (приказ Минздрава РФ № 266 от 19.06.2003 г.). Больные до госпитализации не получали лекарственной терапии и не подвергались рентгенологическим методам обследования. Все обследованные лица подписали добровольное информированное согласие на участие в исследовании и получение от них биологического материала (проб крови и буккального эпителия). Материал для исследования (периферическая кровь для получения культур Т-лимфоцитов и мазки клеток буккального эпителия) был получен в динамике при госпитализации в стационар, а также спустя 1 нед, 1, 3 и 6 мес в острый и реконвалесцентный периоды болезни. У всех обследованных лиц был проведен цитогенетический анализ частоты клеток буккального эпителия с микроядрами в препаратах, окрашенных по Романовскому-Гимза. У каждого обследованного было проанализировано не менее 1000 буккальных клеток. Метод приготовления мазков клеток буккального эпителия, а также методика анализа изложены нами ранее [3]. Культивирование ФГА-стимулированных двухъядерных цитокинез-блокированных Т-лимфоцитов в периферической крови человека с целью получения клеточных суспензий проводили согласно общепринятой методике и рекомендациям [5, 6]. В качестве питательной среды для роста лимфоцитов в периферической крови использовалась питательная среда RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, США) с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (Sigma-Aldrich, США). Для стимулирования деления клеток использовали фитогемагглютинин (10 мкг/мл) (ПанЭко, Россия). После 44 ч культивирования в культуру клеток добавляли цитокинезблокирующий агент цитохалазин В (Sigma-Aldrich, США) до конечной концентрации 5 мкг/мл. Фиксацию клеток в смеси метанола и уксусной кислоты (3:1) и приготовление препаратов начинали через 72 ч после начала культивирования. Препараты окрашивали по Романовскому-Гимза и анализировали не менее 1000 бинуклеарных лимфоцитов с помощью микроскопа PrimoStar (Carl Zeiss, Германия). Для анализа аллелей генов GSTM1 или GSTT1 использовали мультиплексную полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с помощью ДНК амплификатора «Терцик» (НПО «ДНКтехнология», Россия) [1]. Выделение ДНК для ПЦР проводили из эпителиальных клеток ротовой полости человека. В амплификационную пробу вносили две пары праймеров, что давало возможность одновременно амплифицировать фрагменты каждого из указанных генов. Разделение продуктов амплификации и рестрикции ампликонов проводили в горизонтальном 3 % агарозном геле с применением камеры для горизонтального электрофореза ЕС 12-13 (Биоком, Россия). Знак «+» означает присутствие ПЦР-продуктов, и данный донор может быть либо гетерозиготен GSTM1 (+/0) и GSTT1(+/0), либо гомозиготен GSTM1 (+/+) и GSTT1(+/+) по нормальному активному аллелю. Мутантный генотип GSTM1(0/0) или GSTT1(0/0) означает отсутствие на электрофореграмме фрагмента, и данный индивидуум гомозиготен по делеции, что приводит к резкому снижению активности фермента. Статистическую обработку осуществляли с использованием пакета статистических программ Statistica 10.0 (StatSoft Inc., США). Частоты гаплотипов рассчитывали с помощью программы The EH Software Program (Rockefeller University, США). Все количественные показатели исследования обрабатывали с применением однофакторного дисперсионного анализа ANOVA и t-критерия Стьюдента для зависимых выборок, поскольку тестирование закона распределения при помощи критерия Колмогорова-Смирнова не выявило отличий от нормального. Различия сравниваемых результатов (X±m, где X - выборочное среднее арифметическое, m - ошибка среднего арифметического) считались значимыми при р<0,05. Результаты исследования. Результаты показали существенное повышение частоты как клеток буккального эпителия с микроядрами, так и бинуклеарных цитокинезблокированных Т-лимфоцитов в периферической крови с микроядрами у больных КЭ по сравнению с контролем (таблица). Наибольшее повышение частоты клеток с микроядрами было установлено у больных - носителей мутантных аллелей генов GSTM1(0/0) и GSTT1(0/0) по сравнению с группой больных, имевших активные варианты этих генов GSTM1(+) и GSTT1(+). Например, при поступлении в стационар частота буккальных клеток с микроядрами в группе больных КЭ, являвшихся носителями нулевых аллелей генов GSTM1(0/0) и GSTT1(0/0), была значимо выше - 5,11±0,18 %, чем в группе больных с активными вариантами этих генов GSTM1(+)/GSTT1(+) - 2,08±0,09 % (р<0,001). Частота цитокинез-блокированных Т-лимфоцитов в периферической крови у больных КЭ, имевших в своем генотипе мутантные неактивные аллели - 8,08±0,21 %, также была существенно выше, чем в группе больных с нормальными аллелями этих генов GSTM1(+) и GSTT1(+) - 2,92±0,11 %, р<0,001. Аналогичные результаты были получены при сравнении частоты клеток с микроядрами в буккальных клетках и лимфоцитах между группами больных КЭ, имевших сочетание неактивной формы гена GSTM1(0/0) и активного аллеля гена GSTT1(+), и группами больных с активными вариантами обоих генов GSTM1(+)/GSTT1(+) (р<0,001). Вместе с тем, значимых отличий частоты эпителиальных и иммунокомпетентных клеток с микроядрами между группами больных КЭ с генотипами GSTM1(+)/GSTT1(0/0) и GSTM1(+)/GSTT1(+) обнаружено не было (р>0,05). Через 1 нед после курса терапии у больных КЭ было установлено существенное снижение частоты буккальных и лимфоцитарных клеток с микроядрами для всех четырех вариантов генотипов (р<0,001). Однако значение этих показателей оставалось существенно выше, чем в группе здоровых лиц. В группе больных КЭ, имеющих неактивные варианты обоих генов GSTM1(0/0) и GSTT1(0/0), частота клеток буккального эпителия с микроядрами только через 3 мес после курса лечения значимо не отличалась от соответствующих показателей в контроле. А в группах больных КЭ, имеющих активную форму гена GSTM1(+), снижение уровня клеток с микроядрами до сопоставимого со значениями в контрольной группе было отмечено уже через 1 мес. Несколько иной характер цитогенетических последствий отмечен в Т-лимфоцитах в периферической крови. В группах больных КЭ, имеющих четыре варианта генотипа, частота клеток цитокинез-блокированных лимфоцитов с микроядрами становилась достоверно неотличимой от соответствующих показателей в контроле только через 6 мес после курса лечения. Обсуждение полученных данных. Известно, что в начальный период инфекционного процесса, в том числе при КЭ, клетки иммунной системы активно продуцируют реактивные формы кислорода (ROS) и азота (RNS), такие как супероксид-ион радикал, перекись водорода, а также оксид азота и пероксинитрит [11]. Установлено, что непропорционально высокая генерация этих высокореактивных соединений может повреждать клеточные макромолекулы, включая ДНК и ферменты [2, 11]. Таким образом, цитогенетические эффекты, которые обнаружены у больных КЭ, по-видимому, связаны с окислительным стрессом, вызванным внедрением инфекционного агента в организм [2]. Под влиянием реактивных форм кислорода в клетках происходит разрушение микротрубочек, что способствует аномальному расхождению хромосом в митозе и формированию микроядер в различных типах клеток, включая лимфоциты и буккальные клетки [6]. Известно, что группа ферментов глутатион-Sтрансфераз, кодируемых генами GSTM1 и GSTT1, выполняет роль антиоксидантов, приводящих к снижению числа клеток с цитогенетическими нарушениями. Поэтому мутации в этих генах, вызывающие их инактивацию, способствуют клинически более тяжелому течению инфекционных заболеваний [7, 9]. Активация продукции реактивных форм кислорода и азота при инфекционном процессе и воспалении способствует разрушению глутатиона, что, возможно, приводит к снижению протективной функции глутатионS-трансфераз при инфекционных заболеваниях, включая КЭ. Таким образом, у больных КЭ установлено повышение частоты и длительное персистирование клеток с микроядрами как в буккальном эпителии полости рта, так в Т-лимфоцитах в периферической крови по сравнению с группой здоровых лиц. Наиболее существенное повышение этих показателей было выявлено у больных КЭ, в генотипе которых присутствовали неактивные мутантные варианты генов GSTM1(0/0) и GSTT1(0/0). У больных, перенесших КЭ, показано более длительное сохранение цитогенетической нестабильности на протяжении до полугода в Т-лимфоцитах в периферической крови по сравнению с буккальными клетками в полости рта, где частота клеток с микроядрами была сопоставима с соответствующими показателями в контрольной группе уже через 1-3 мес. Источник финансирования. Исследование выполнено при финансовой поддержке грантов РФФИ (№ 16-40700149) и РГНФ (№ 06-15-10190). Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: И. О. А. Статистическая обработка: А. М. Д. Анализ полученных данных: Н. Н. И. Написание и редактирование текста: Е. Н. И. Сбор и обработка материала: Е. В. З. Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов в данной статье.

About the authors

O. V. Anan’eva

Tyumen State Medical University

Email: olvasan@mail.ru
Department of Clinical Laboratory Diagnostics 54 Odesskaya St., Tyumen 625023

N. N. Ilyinskikh

National Research Tomsk State University; Siberian State Medical University

Email: nauka-tomsk@yandex.ru
Department of Ecology, Environmental Sciences and Environmental Engineering; Department of Biology and Genetics 36 Lenin Avenue, Tomsk 634050; 2 Moscow tract, Tomsk 634050

E. N. Ilyinskikh

National Research Tomsk State University; Siberian State Medical University

Department of Ecology, Environmental Sciences and Environmental Engineering; Department of Biology and Genetics 36 Lenin Avenue, Tomsk 634050; 2 Moscow tract, Tomsk 634050

E. V. Zamyatina

Siberian State Medical University

Email: infconf2009@mail.ru
Department of Biology and Genetics 2 Moscow tract, Tomsk 634050

A. M. Durov

Tyumen State University; Tyumen State Medical University

Email: amdurov@mail.ru
Department of Physical Culture and Sport, Institute of Physical Education; Department of Biology and Genetics 6 Volodarskogo St., Tyumen 625003

References

Supplementary files