HISTOMORPHOMETRIC CHANGES OF THE KNEE JOINT CARTILAGE AND SYNOVIAL MEMBRANE IN THE FORMATION OF EXPERIMENTAL POSTTRAUMATIC OSTEOARTHROSIS

Full Text

Синовиальная оболочка, синовиальная жидкость и суставной хрящ формируют специфическую внутреннюю синовиальную среду сустава как органа, обеспечивающего локомоторные возможности организма. Функциональное состояние сустава зависит от целостности составляющих его структурных элементов, метаболического статуса, эндокринной и иммунной систем организма, васкуляризации субхондральной кости и синовиальной оболочки, а также биомеханической нагрузки и действия различных повреждающих факторов. Любое нарушение синовиального гомеостаза влечет за собой те или иные изменения в суставном хряще [8, 9]. Травма сустава сопровождается формированием каскада патологических процессов, индуцирующих острую воспалительную реакцию хряща и синовиальной оболочки, а также развитие структурно-функциональных нарушений, приводящих к посттравматическому остеоартрозу [4, 9]. Нарушается биосинтетическая активность хондроцитов, в результате чего образуется короткоцепочный нефибриллярный коллаген, что значительно снижает регенеративные возможности хряща [7, 8]. Большое значение имеет активация перекисного окисления липидов, продукты липопероксидации усугубляют деструкцию хондроцитов и межклеточного матрикса суставного хряща, поддерживают течение хронического воспаления. Фрагменты коллагена и протеогликаны, попадая при деструкции хряща в синовиальную жидкость, способствуют развитию иммунопатологических реакций в синовиальной оболочке [2, 5]. Несмотря на многочисленные исследования в области данной патологии, остается малоизученной морфологическая основа структурнофункциональных нарушений, формирующихся в суставе после его травматического повреждения, что является важным для определения прогноза и тактики лечения [6]. Цель работы - гистологическое и морфометрическое исследование структур сустава в норме и сравнительном аспекте с изменениями, формирующимися после моделирования травматического повреждения. Материал и методы. Эксперименты проведены на 42 белых нелинейных крысах обоего пола массой 180-200 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария ФГБОУ ВО «МГУ им. Н. П. Огарева». Исследования были одобрены локальным этическим комитетом Медицинского института ФГБОУ ВО «МГУ им. Н. П. Огарева» (протокол № 44 от 18.11.2016 г.). Животные были разделены на 2 группы. Первую составили интактные животные в количестве 12 крыс. Во второй группе (30 животных) под комбинированной анестезией (золетил 100 в дозе 0,05 мг/кг и ксилазина гидрохлорид в дозе 1 мг/ кг внутримышечно) моделировали повреждение коленного сустава механическим путём в модификации Г. М. Дубровина [3]. В асептических условиях рассекали кожу и капсулу сустава. В полость сустава вводили иглу Дюфо, обточенную под углом 90º и ориентированную на хрящ внутреннего мыщелка бедренной кости. Ввинчивающими движениями перфорировали суставной хрящ до упора в субхондральную кость, затем иглу удаляли. Получение фрагмента суставного хряща контролировали мандреном. Швы на рану накладывали через все слои. Исследования проводили на 3-, 15-, 28-е сутки. Из эксперимента животных выводили под наркозом путем декапитации. У экспериментальных животных исследовали макроскопическую структуру полости сустава. Гистологическим методом изучали морфологию суставного хряща, синовиальной оболочки и субхондрального слоя костной ткани. Материал декальцинировали в трилоне Б, фиксировали в 10 % растворе формалина и заключали в парафин. Серийные срезы окрашивали гематоксилином - эозином. С целью изучения структуры экстрацеллюлярного матрикса, для визуализации деструкции глюкозаминогликанов хряща в виде очагов метахромазии производили окраску срезов тиозиновым красителем - метиленовым синим. С гистологических препаратов на микроскопе HUMASCOPE ADVANCED LED (Human GmbH, Германия) были сделаны микрофотографии цифровой фотокамерой Human GmbH (USB) 8,0 Мпикс (Human GmbH, Германия). Морфометрическое исследование суставного хряща и синовиальной оболочки проводили после оцифровки препаратов с помощью программного комплекса Image J for Windows при конечном увеличении в 400 раз. Измеряли толщину хряща и покровного слоя синовиальной оболочки. Численную плотность хондроцитов оценивали с помощью закрытой тестовой системы известной площади (1 мм2), состоящей из 81 точки по методике Г. Г. Автандилова (1990) в 10 полях зрения [1]. За норму принимали сустав интактного животного. Статистическую обработку количественных данных осуществляли с помощью статистического пакета MS Excel 2007 и пакета прикладных программ Statistica 6.0. Вычисляли среднее значение (M) и ошибку среднего (m). Результаты исследования представлены в виде значений М±m. При сравнении групп использовали параметрический критерий Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при р<0,05. Результаты исследования. При макроскопическом исследовании коленного сустава у группы интактных животных гиалиновый хрящ был гладким и блестящим, розоватого цвета, упругим по структуре, прочно фиксирован к субхондральной кости. Суставные поверхности не разволокнены. Морфологически в суставном хряще определялись 3 основные структурные зоны: поверхностная, промежуточная и глубокая. Базальная линия отделяла обызвестленный хрящ от подлежащей субхондральной кости. Субхондральная кость переходила в хорошо васкуляризованную трабекулярную часть эпифиза. В межтрабекулярных промежутках содержался красный костный мозг (рис. 1). При окраске метиленовым синим межклеточное вещество хряща окрашивалось гомогенно во всех зонах, очаги метахромазии не визуализировались. Покровный слой синовиальной оболочки представлен фибробластоподобными синовиоцитами, располагающимися в 1-2 слоя, коллагеновоэластический слой имел волокнистое строение без воспалительных изменений (таблица). На 3-и сутки после моделирования травматического повреждения коленного сустава определялись отек мягких тканей, нарушение опорной функции конечности. При артротомии выделялась жидкость синовиально-геморрагического характера. В проекции медиального мыщелка визуализировался округлый дефект. Отмечалась гиперемия синовиальной оболочки. Микроскопически в области медиального мыщелка был выявлен глубокий дефект, доходящий до субхондральной кости, заполненный хрящевым детритом, содержащим хондроциты с явлениями кариопикноза и кариорексиса. Гистоархитектоника и вертикальная столбчатость лакун хондроцитов промежуточной зоны была сохранена, отмечалось набухание структур. Глубокая зона имела типичное строение с колончатым расположением хондроцитов. Определялись истончение костных трабекул, увеличение межтрабекулярных промежутков субхондральной кости медиального мыщелка. В синовиальной оболочке и капсуле сустава отмечались диффузная воспалительная клеточная инфильтрация, полнокровие с развитием агрегации и стаза эритроцитов. К 15-м суткам эксперимента отек незначительно уменьшился, но нарушение функции конечности сохранялось. Макроскопически хрящ потерял блеск, имел тускло-желтоватый оттенок. Экспериментальный дефект увеличился в размерах, его дно было выстлано созревающей грануляционной тканью. Отмечались очаговое отслоение поверхностной бесклеточной пластинки в поверхностной зоне, дезорганизация хрящевой ткани, проявляющаяся разволокнением межклеточного матрикса, образованием узур. В промежуточной зоне лакуны хондроцитов располагались беспорядочно, обнаруживались пустые лакуны и дегенеративные изменения хондроцитов. В глубокой зоне было выявлено колончатое расположением хондроцитов с явлениями деструкции. Определялось неравномерное окрашивание базофильной линии с ее расслоением и истончением. В субхондральном слое прослеживались явления остеолиза, признаки структурных нарушений кровообращения, развитие эндоваскулитов. При окраске метиленовым синим в поверхностной и промежуточной зонах хряща прослеживались очаги метахромазии (снижение интенсивности, очаговое окрашивание), разволокнение межклеточного вещества с явлениями демаскировки коллагеновых волокон. На 28-е сутки определялась стойкая сгибательная контрактура в поврежденном суставе, при передвижении животные хромали и щадили травмированную конечность. Макроскопически суставные поверхности хряща были желтоватого цвета с синюшными пятнами, без блеска, синовиальная жидкость - мутная. Травматический дефект заполнялся фиброзной тканью с разрастаниями, выходящими за его пределы, изменяя конгруэнтность суставных поверхностей. Микроскопически в области дефекта было обнаружено разрастание соединительной ткани с формированием большого количества фиброзных сращений с окружающими структурными элементами сустава. В перифокальной области отсутствовала зональная структура хрящевой ткани, идентифицировались глубокие узуры, доходящие до середины глубокой зоны. В поверхностной зоне отмечались отслоение поверхностной бесклеточной пластинки, разволокнение и фибриллярность коллагеновых волокон (рис. 2). Местами бесклеточная пластинка полностью разрушена, и суставная поверхность представлена фибриллярными участками, преобладали хондроциты с пикнотичными ядрами и в состоянии гибели. Хондроциты промежуточной зоны располагались одиночно, имели аномальную форму с пикнотичными ядрами, отсутствовала колончатая структура, определялись запустевшие лакуны. Матрикс промежуточной зоны был волокнистым, слабоэозинофильной окраски. Наблюдались неравномерное окрашивание, расслоение базофильной линии в отдельных участках с нарушением ее целостности и проникновением сосудов со стороны субхондральной зоны в хрящ. В субхондральной кости обнаруживались признаки нарушения микроциркуляции, участки очагового остеосклероза с утолщением костных трабекул. Полученные новые данные морфометрического исследования толщины суставного хряща при экспериментальном посттравматическом артрите позволили обнаружить значительное увеличение общей толщины хряща на 37,0 % (р<0,001) по сравнению с серией интактных животных (см. таблицу). В связи с деградацией межклеточного матрикса, воспалительным отеком основного вещества и коллагеновых волокон увеличились все зоны хрящевого матрикса. Следует отметить более значительное вовлечение в патологический процесс поверхностной зоны хряща, толщина которой возрастала на 98,0 % относительно нормы. Полученные данные обусловлены развивающимся внутриполостным воспалением и повреждающим действием протеолитических ферментов, цитокинов, медиаторов воспаления и продуктов свободнорадикального окисления, продуцируемых иммунокомпетентными клетками, а также нарушением трофической функции синовиальной жидкости. Проведенный морфометрический анализ численной плотности хондроцитов выявил значительное ее снижение на 21,1 % (р<0,001), причем преимущественно в поверхностной и промежуточной зонах, что отражает угнетение регенеративных возможностей хряща (см. таблицу). При окраске метиленовым синим во всех слоях хряща отмечалась метахроматическая реакция в виде окрашивания разной степени выраженности. Обнаружение участков разволокнения коллагена связано с разрушением гликозаминогликанов внеклеточного матрикса хряща с демаскировкой волокон и развитием некротических изменений межуточного вещества. В синовиальной оболочке определялась картина хронического посттравматического синовита в виде утолщения капсулы и синовиальной оболочки, фиброза синовиальных складок. В очагах гиперплазии преобладали макрофагальные синовиоциты, которые располагались в 3-4 слоя. Толщина покровного слоя синовиальной оболочки в 2,7 раза превышала показатель интактной серии животных (см. таблицу). Определялись явления тромбоза и ангиоматоза сосудов субсиновиального слоя. Обсуждение полученных данных. Гистологическое исследование хряща и синовиальной оболочки после экспериментального травматического повреждения сустава выявило формирование необратимых дегенеративнодеструктивных процессов в суставе, которые захватывали все слои хряща, распространялись далеко от повреждения и преобладали в поверхностной зоне. Полученные результаты к 28-м суткам эксперимента свидетельствовали о нарушении структурно-функциональной организации сустава, характеризующимся разрушением суставных поверхностей, формированием глубоких узур, дезорганизацией и деструкцией коллагеновых фибрилл, развитием склероза синовиальной оболочки, уменьшением численной плотности хондроцитов. Формирование подобных необратимых дегенеративно-деструктивных посттравматических изменений суставов отражено в работах ряда авторов [3, 8]. Выявленные морфологические изменения в суставе соответствовали III-IV степени остеоартроза, согласно гистологической классификации Международного общества изучения остеоартроза OARSI [10]. Полученные новые данные морфометрического анализа общей толщины хряща и его зон после экспериментального травматического повреждения сустава свидетельствовали о значительном увеличении поверхностной зоны суставного хряща относительно нормы преимущественно за счет нарастающего отека и разволокнения коллагеновых волокон вследствие деструкции гликозаминогликанов, определяемых при окраске тиозиновым красителем. Изменения внеклеточного матрикса формировались на фоне значительного снижения численной плотности хондроцитов, играющих главную роль в репаративной регенерации хряща. Структурно-функциональные нарушения в суставе определялись на фоне хронического посттравматического синовита и развивающихся дегенеративных процессов синовиальной оболочки, проявляющихся фиброзом синовиальных складок, тромбозом сосудов субсиновиального слоя, что сопровождалось значительным увеличением толщины ее покровного слоя (в 2,7 раза). Вследствие этого нарушается трофика хряща и синовиальной оболочки, а повреждающее действие высвобождающихся протеолитических ферментов, цитокинов, медиаторов воспаления и продуктов свободнорадикального окисления на хондроциты и внеклеточный матрикс замыкают формирующийся порочный круг. Результаты исследования имеют большое практическое значение, так как обосновывают необходимость разработки принципиально новых методов воздействия на предикторы посттравматической альтерации хряща и синовиальной оболочки в ранние сроки после повреждения, направленные на предупреждение развития необратимых деструктивно-дистрофических изменений в суставе и профилактику остеоартроза. Таким образом, снижение численной плотности хондроцитов при экспериментальном посттравматическом артрите к 28-м суткам способствует формированию необратимых деструктивных изменений в суставном хряще, что обусловлено угнетением репаративных процессов и нарушением метаболизма внеклеточного матрикса хряща. Деструктивные изменения преобладают преимущественно в поверхностной и промежуточной зоне хряща и связаны с дегенеративным перерождением синовиальной оболочки, сопровождающимся значительным увеличением толщины покровного слоя и развитием хронического посттравматического синовита. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: А. Н. З. Сбор и обработка материала: А. Н. З., Т. В. Т., И. А. З. Статистическая обработка данных: И. А. З., А. А. Ч. Анализ и интерпретация данных: А. Н. З., Т. В. Т. Написание и редактирование текста: А. Н. З. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

About the authors

A. N. Zakhvatov

N. P. Ogarev National Research Mordovia State University

Email: zachvatan78@mail.ru
N. I. Atyasov Department of General Surgery 68 Bolshevistskaya St., Saransk 430005

T. V. Tarasova

N. P. Ogarev National Research Mordovia State University

Department of Normal and Pathological Physiology 68 Bolshevistskaya St., Saransk 430005

I. A. Zakharkin

N. P. Ogarev National Research Mordovia State University

N. I. Atyasov Department of General Surgery 68 Bolshevistskaya St., Saransk 430005

A. A. Chekmayeva

N. P. Ogarev National Research Mordovia State University

N. I. Atyasov Department of General Surgery 68 Bolshevistskaya St., Saransk 430005

References

Supplementary files